* Ульяновский государственный университета, ** Казанский государственный медицинский университет

    Если в здоровой ткани существует баланс между процессами пролиферации и гибели клетки, то в ткани опухоли имеет место автономная и неограниченная пролиферация клеток. В трансформированных клетках в результате генетических мутаций снижается способность активировать программу апоптоза, что, с одной стороны, способствует прогрессированию опухолевого процесса, а с другой – может стать причиной множественной лекарственной устойчивости [1]. В связи с этим представляет интерес изучение молекулярных маркеров, характеризующих апоптоз и пролиферацию как при злокачественных новообразованиях, различной локализации, так и в динамике прогрессирования неоплазмы.
    Целью работы была оценка маркеров апоптоза и пролиферации опухолевой ткани при раке яичников в динамике прогрессирования опухоли.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования послужили гистологические препараты операционно-биопсийного материала первичной опухоли 83 первичных больных раком яичников (РЯ). По стадиям заболевания (FIGO,1976) больные распределились следующим образом: I стадия была у 4 (4,8%), II – у 6 (7,2%), III – у 40 (48,2%), IV – у 33 (39,8%). При оценке пролиферативной активности использовали моноклональные коммерческие антитела фирм Novocastra и Dako к  антигену ядер пролиферирующих клеток PCNA и к негистонному белку Ki-67. Пролиферативная активность опухоли оценивалась как процент Ki-67- положительных клеток от общего числа опухолевых клеток. Для оценки индекса  пролиферации по PCNA высчитывали процент клеток, в ядрах которых выявлялась экспрессия  PCNA, на 300 раковых клеток.
    В иммуногистохимической оценке экспрессии mtp53 использовали мышиные моноклональные антитела р53, клон DO-7, Ig G2b (M7001 DakoCytomation) в разведении 1:100 при времени экспозиции 60 мин. Критерием положительной реакции считалась окраска 10% и более ядер опухолевых клеток. Bcl-2 обнаруживался с помощью моноклональных антител к bcl-2, клон Bcl-2/100/D5, IgGi (NCL-bcl-2 Novocastra) в разведении 1:80 при инкубации 60 мин. Положительной считалась реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 10% опухолевых клеток.
    Полученные в ходе исследования результаты оценивали с использованием непараметрических статистических методов. Значимость различий между группами определяли с использованием H-критерия Крускала-Уоллиса. Силу связи между признаками устанавливали ранговой корреляцией Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В литературе не существует единого мнения по поводу уровня экспрессии Ki-67 при РЯ [11]. Показано, что индекс  Ki-67 коррелирует со степенью дифференцировки опухоли при серозном РЯ [5] и зависит от гистотипа опухоли. В результате проведенных исследований было установлено, что на I клинической стадии РЯ  количество Ki-67+ -клеток невелико и составляет порядка 5,4±0,63%.
При прогрессировании неоплазмы (III стадия) обнаруживается тенденция к усилению экспрессии Ki-67 (табл.1).

Таблица 1. Средние значения индекса пролиферации Ki-67 и уровень экспрессии PCNA в атипических эпителиальных клетках яичника на различных клинических стадиях заболевания

Примечание: * - различие с данными на предыдущей клинической стадии статистически значимо (p=0,0001).

    Исследование раковых опухолей яичников IV стадии показало сохранение высокой пролиферативной активности: экспрессия Ki-67 в ряде случаев достигала 58%.
    Оценка пролиферативной активности неоплазмы выявила, что на I и II клинических стадиях РЯ уровень PCNA демонстрирует значительные колебания от 18 % до 32%. При прогрессировании новообразования (III-IV стадии) количество PCNA-положительных клеток значительно возрастает (табл.1), достигая в ряде случаев 100%.
    р53 – полифункциональный белок, основная функция которого реализуется в ядре. Ген р53 постоянно транскрибируется и транслируется, однако сам белок быстро деградирует в протеосомах и в клетках большинства тканей находится на пороге детекции. Считается, что иммуногистохимическая положительная реакция полностью зависит главным образом от наличия мутантного типа mt 53 [6]. Последний уже не выполняет своих функций и деление клеток ставится неуправляемым процессом [9]. Полагают, что мутации р53 могут как инициировать канцерогенез (синдром Ли-Фраумени) или определять его начальные этапы, так и возникать в процессе роста опухоли, обеспечивая ее  новые агрессивные свойства [3]. Мутантный р53 определяется при многих злокачественных образованиях. В злокачественных эпителиальных опухолях яичников экспрессия р53 может достигать 80% [8].
    Результаты проведенного нами исследования по оценке экспрессии антигена р53 атипическими эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ представлены на рис.1.

    Установлено, что при прогрессировании РЯ увеличивается количество атипических эпителиальных клеток опухоли, экспрессирующих р53. При этом достоверность различий между группами статистически значимая (р=0,0001) и корреляция со стадией положительная высокая (r=0,6092). Полученные результаты позволяют предполагать, что в процессе прогрессирования первичной опухоли либо нарастают мутации гена р53, либо имеет место отбор р53+ опухолевых клеток, обеспечивающих более агрессивное течение.     Наряду с р53 наиболее последовательно изучается в апоптозе роль гена bcl-2. Установлено, что Bcl-2 подавляет Fas-зависимый апоптоз [2]. Данные относительно уровня экспрессии белка Bcl-2 и возможностей использования его в качестве прогностического фактора у больных с солидными опухолями достаточно противоречивы [1].
    Результаты проведенного нами исследования по оценке экспрессии антигена Bcl-2 атипическими эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ представлены на рис.1. Показано, что при прогрессировании РЯ количество клеток опухоли, экспрессирующих Bcl-2, увеличивается. Достоверность различий между стадиями статистически значимая (р=0,0001), и корреляция со стадией положительная высокая (r=0,6255).
    Для опухолевых клеток характерны генетические изменения, ведущие к ослаблению различных путей апоптоза, в частности, ингибирование проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С и AJF вследствие изменения экспрессии белков семейств Bcl-2. Считается, что гиперэкспрессия Bcl-2 приводит к неопластическому процессу. В то же время показано, что утрата экспрессии этого белка коррелирует с плохим прогнозом при РМЖ и его гиперэкспрессия является благоприятным прогностическим признаком при РЯ [4]. Существует также мнение, что экспрессия  Bcl-2 не всегда блокирует апоптоз [10]. Вероятно, в разных типах опухолей проявляется разная роль Bcl-2.
    Таким образом, на основании вышеизложенного можно предполагать, что в процессе прогрессирования РЯ в первичном опухолевом узле, возможно, имеет место отбор р53+ неопластических клеток, характеризующихся высокой пролиферативной активностью, и гиперэкспрессией онкопротеина Bcl-2. Поскольку изученные маркеры пролиферации и апоптоза имеют непосредственное отношение к радио- и химиочувствительности неоплазмы [7], полученные результаты могут быть использованы при выборе оптимальных схем лечения и оценке прогноза РЯ на различных клинических стадиях заболевания.

ЛИТЕРАТУРА
1. Абраменко И.В., Фильченков А.А. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопр.онкол. – 2003. – Т.49, №1. – С.21-30.
2. Акимов А.А., Иванов С.Д., Хансон К.П. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований. // Вопр.онкол. – 2003. – Т.49, №3. – С.261-269.
3. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. – 2000. – Т.65. – С.5-33.
4. Мильчаков Д.Е. Клинико-морфологическая характеристика серозного рака яичников у женщин (на примере Кировской обл.). – Автореф. дисс. к.м.н. :С-Пб, 2007 г.
5. Полушкина И.Н. Биомолекулярные маркеры как факторы прогноза при серозном раке яичников III-IV стадии. – Автореф. дисс. к.м.н., Москва, 2002 г.
6. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В.Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2004.
7. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2004 г. / Под ред. М.И.Давыдова и Е.М.Аксель. // Вестник РОНЦ им И.Н.Блохина. – 2006. – Т.17, №3. – С.97.
8. Cao Y, Pieretti M, Marshall J, Khattar NH, Chen B, Kam-Morgan L, Lynch H. Challenge in the differentiation between attenuated familial adenomatous polyposis and hereditary nonpolyposis colorectal cancer: case report with review of the literature. // Am J Gastroenterol. 2002 Jul;97(7):1822-7.
9. Cloven NG, Kyshtoobayeva A, Burger RA, Yu IR, Fruehauf JP. In vitro chemoresistance and biomarker profiles are unique for histologic subtypes of epithelial ovarian cancer. // Gynecol Oncol. 2004 Jan;92(1):160-6.
10. Kuwashima Y, Kobayashi Y, Kawarai A, Uehara T, Kurosumi M, Tanuma J, Shiromizu K, Matsuzawa M, Kishi K. Expression of bcl-2 and apoptotic DNA fragmentation in human endometrial adenocarcinoma cells. // Anticancer Res. 1996 Sep-Oct;16(5B):3221-4.
11. Pieretti M, Hopenhayn-Rich C, Khattar NH, Cao Y, Huang B, Tucker TC. Heterogeneity of ovarian cancer: relationships among histological group, stage of disease, tumor markers, patient characteristics, and survival. // Cancer Invest. 2002;20(1):11-23.