Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. А.Н. Глушков

Учреждение РАН Институт экологии человека Со РАН, г. Кемерово,

²Учреждение РАН Институт химической биологии и фундаментальной меди­цины СО РАН, г. Новосибирск

Эта работа была опубликована в cборнике материалов I Всероссийской научной студенческой конференции с международным участием «МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ», под редакцией проф., д-ра мед. наук С.И. Карася (г. Томск, 10-11 ноября 2011 года).

Введение. По данным отечественных и зарубежных эпидемиологи­ческих исследований частота врожденных пороков развития у плода и новорожденного (ВПРПН) до сих пор остается достаточно высокой [2]. Их возникновение обусловлено генетическими и средовыми причинами [1]. При одинаковом воздействии генотоксических внешних факторов на беременных женщин, не у всех формируются ВПРПН. Это связано с ге­нетически детерминируемой чувствительностью отдельных женщин к этим факторам. В связи с этим особую важность приобретает поиск ге­нетических маркеров в генах метаболизма тератогенов (глютатион-S-трансферазы) и в генах иммунной защиты от ксенобиотиков (интерлей-кины). До сих пор мало изученной остается связь сочетания этих генов с ВПРПН.

Цель работы. С целью поиска генетических маркеров изучали ас­социации материнских генов IL1aR, IL1(3, IL4, IL6, GSTT1 и GSTIVI1 с врожденными пороками развития у плода и новорожденного.

Материал и методы. Проведено обследование 538 женщин, про­живающих на территории Кемеровской области. Группу сравнения со­ставили 298 женщин, у которых отсутствовали в анамнезе спонтанные аборты и ВПРПН. На момент обследования 150 (50,3%) женщин были с физиологическим течением беременности в сроки 15-35 недель, а 148 (49,7%) женщин - роженицы условно «здорового» ребенка. Средний возраст обследуемых женщин был 26,6 лет. Исследуемую группу соста­вили 240 женщин. Из них 165 (68,8%) женщин были беременными (15­35 недель) и вынашивали плод, у которого с помощью ультразвукового исследования был установлен врожденный порок, а 75 (31,3%) - роже­ницы с диагнозом - врожденный порок развития у новорожденного. В соответствии с Международной классификацией болезней (МКБ-10: Q00-Q99) структура врожденной аномалии была следующей: пороки сердечнососудистой системы (22,9%); пороки мочевыделительной си­стемы (22,2%); множественные пороки развития плода (17,6%), патоло­гия ЦНС (17,1%); пороки костно-мышечной системы (10,2%); пороки пи­щеварительной системы (6,3%); расщелина губы и/или неба (3,8%). Средний возраст женщин в группе составил 25,6 лет. Изучаемые групп по возрасту статистически значимо не отличались друг от друга (р>0,05).

Геномную ДНК выделяли из лейковзвеси периферической крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом. Тест-системы для молекулярно-генетического анализа полиморфизма IL1aR (интрон 2, VNTR 86 н.п.), IL1(3 (+3953, С->T), IL4 (интрон 3, VNTR 70 н.п.), IL6 (-174, G->C), GSTT1 и GSTM1 раз­работаны в ИХБФМ СО РАН (г. Новосибирск). Полиморфизмы IL1(3 и IL6 выявляли с помощью ПДРФ ферментом Taq I (ООО «СибЭнзим», г. Но­восибирск). Генотипирование IL1aR и IL4 проводили методом ПЦР, а GSTT1 и GSTI1 - мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени, как описано в работе [3]. Ге-терозиготы по мутации (генотип +/0) рассматривались в одной группе с носителями нормальных генов (+). Статистическую обработку получен­ных результатов проводили с помощью четырехпольной таблицы со­пряженности с поправкой Йетса на непрерывность вариации (х²). Нуле­вую гипотезу отвергали при p<0,05. Ко всем экспериментально установ­ленным значениям уровня значимости была применена поправка Бонферрони (p < 0,05/m),  где m - количество независимых статистических тестов на уровне значимости а. На первом этапе количество независимых статистических тестов составило 6, на втором - 82 с целью исключения статистических ошибок при множественных сравнениях. Силу ассоциа­ции анализируемых признаков определяли с помощью величины отно­сительного риска (RR).

Результаты и обсуждение. Не выявлено ассоциаций аллелей и ге­нотипов с рисков развития ВПРПН для следующих полиморфизмов: IL1aR (интрон 2, VNTR 86 н.п.), IL1(3 (+3953, С->Т), IL4 (интрон 3, VNTR 70 н.п.), IL6 (-174, G->C) и GST М1. Ассоциация с риском развития ВПРПН выявлена только для генотипа GSTT1 «0». Частота встречаемо­сти GSTT1 «0» у женщин с ВПРПН составила 36,2%, в то время как в контрольной группе 13,8% (х²=35,86, p=0,00001, р_с=0,00006, RR=3,54). Напротив, генотип GSTT1 «+» значимо чаще наблюдался в контрольной группе, чем у женщин c ВПРПН (86,2% против 63,8%, RR=0,28). Ранее отдельные исследователи выявили ассоциации материнского GSTT1«0» с другими ВПРПН (дефект неба и губы, гипоспадия), а также с внутри­утробной задержкой развития плода. Как известно, для большинства случаев заболеваний генотип GSTT1 «+» у людей проявляет защитный эффект [4]. Подобная ситуация была выявлена в нашем исследовании, где женщины с генотипом GSTT1 «+» значимо чаще вынашивали ребен­ка без внутриутробной патологии. Следовательно, материнский генотип GSTT1 «+» можно рассматривать в качестве маркера устойчивости к ВПРПН.

На следующем этапе изучали ассоциации сочетаний материнских генотипов отдельных генов интерлейкинов (IL1aR, IL1(3, IL4, IL6) с GST при ВПРПН. Как оказалось, для сочетаний изучаемых генов интерлейки-нов и GSTI1 статистически значимые отличия отсутствовали. При ис­следовании трехчленных комбинаций генотипов интерлейкинов и GSTT1 мы провели сравнение 82 вариантов сочетаний. С учетом по­правки Бонферрони для данного количества вариант величина уровня значимости ассоциации должна составлять менее (0,05/82) = 0,0006. Из всех проанализированных трехчленных комбинаций только генотип, со­стоящий из сочетания полиморфных вариантов генов: IL1aR 4R/4R, IL1 в C/C, GSTT1 «0», удовлетворял этому условию. Частота встречаемости этого генотипа у женщин с ВПРПН составила 44,44%, у женщин кон­трольной группы 13,64% (х²=15,77, p=0,0006, RR=4,5). Таким образом, у носителей этого генотипа более чем в 4 раза увеличивался риск разви­тия ВПРПН. В литературе имеются сообщения об ассоциации GSTT1 «0» матери с ВПР у ее потомства [5]. Кроме того, обнаружено, что у лю­дей с генотипом GSTT1 «0» наблюдалась более низкая секреция воспа­лительных цитокинов (TNF-а и IL6) в отличие от людей с GSTT1 «+». В отношении полиморфизма IL1aR у беременных женщин было установ­лено, что у женщин с генотипом IL1aR 2R,2R отмечалась высокая кон­центрация вагинального белка IL1aR, а у женщин с генотипом IL1aR 4R,4R - низкая. По-видимому, у женщин с генотипом GSTT1 «0» отсут­ствие компенсаторных эффектов со стороны иммунной системы (слабый иммунный ответ, детерминированный IL1aR 4R,4R и IL1 в C/C) может способствовать формированию ВПР у потомства. В нашем исследова­нии материнский полиморфизм гена GSTT1 оказывал влияние на обра­зование ВПРПН. При изучении сочетаний полиморфизмов генов систе­мы интерлейкинов с геном биотрансформации ксенобиотиков относи­тельный риск развития заболевания увеличился с 3,5 до 4,5.

Выводы. Материнские гены GSTT1 и IL1 (aR, в) оказывают влияние на формирование ВПРПН. Выявлены положительные ассоциации с ВПРПН: GSTT1 «0» и сочетание IL1aR 4R/4R, IL1 в C/C, GSTT1 «0», а также отрицательные ассоцации: GSTT1 «+» и сочетание IL1aR 4R/4R, IL1 в C/C, GSTT1 «+». Исследование генетических полиморфизмов ге­нов интерлейкинов и фермента II фазы детоксикации ксенобиотиков у женщин репродуктивного возраста рекомендуется для выявления групп женщин с высоким риском развития врожденной аномалий у ребенка.

Список литературы:

1.            Демикова Н.С., Хандогина Е.К., Воробьева Л.М., Федотова Н.А., Кобринский Б.А. Сравнительный анализ частоты врожденных пороков развития в регионах расположения предприятий ядерного топливного цикла // Экологическая гене­тика. - 2010. - ТЛ/III, вып.2. - С. 29-35.

2.            Хаматханова Е.М., Кучеров Ю.И. Эпидемиологические аспекты врожденных по­роков развития // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2007. - №6. - С. 35-39.

3.            Kostrykina N.A., Pechkovskii E.V., Mishukova O.V. et al. Studying the association of polymorphic variants of GSTM1 and GSTT1 genes with breast cancer in female resi­dents of Altai Krai // Bulletin Experimental Biology and Medicine. - 2009. - Vol. 148, №1. - P. 89-93.

4.            Landi S. Mammalian class theta GST and susceptibility to carcinogens: a review. // Mutation Research. - 2000. - Vol. 463. - P. 247-283.

5.    van Rooij I.A., Wegerif M.J., Roelofs H.M. et al. Smoking, genetic polymorphisms in biotransformation enzymes, and nonsyndromic oral clefting: a gene-environment in­teraction // Epidemiol. - 2001. - Vol. 12, №5. - P. 502-7.