Дагестанская Государственная Медицинская Академия, (г.Махачкала)

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 5), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Повреждение светом биологических структур в присутствии кислорода, сенсибилизированное введенным в организм красителем (фотодинамическое действие), нашло применение в методе фотодинамической терапии опухолей. Многие аспекты фотодинамического действия до сих пор остаются не выясненными, в частности, остаются неясными механизмы преимущественного повреждения опухолевых клеток. Известно, что величина pH цитоплазмы может служить оценкой физиологического состояния клеток. Целью данной работы было сравнительное изучение динамики цитоплазматического рН в единичных интактных клетках нормальных и раковых культивируемых линий при фотодинамическом действии.
Материалы и методы. Объектом исследования служили монослойные культуры клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ и опухоли шейки матки HeLa, культивировавшиеся по стандартной методике. Сенсибилизатором служил гематопорфирин (ГП) в концентрации 10-4 моль. [1]. Для измерения величины цитоплазматического рН использовался флуоресцентный метод прижизненной рН-метрии с использованием флуоресцеиндиацетата (ФДА) [2]. Инкубация клеток с ФДА приводила к накоплению в клетках производного ФДА - флуоресцеина (Ф), имеющего рН - зависимый спектр флуоресценции. Величина рН оценивалась по отношению интенсивностей флуоресценции Ф на двух длинах волн (518 и 570 нм) при возбуждении флуоресценции в изобестической точке 460 нм. Метод позволяет измерять рН цитоплазмы в диапазоне 5,6 - 7,5 единиц рН, погрешность метода составляет 0,15 рН.
Результаты и обсуждение. Инкубация с ГП в темноте не приводила к достоверному изменению цитоплазматического pH для клеток обеих культур. (Время темновой инкубации изменялось от 1 до 6 часов). Непрерывное облучение светом с длиной волны 400 нм, соответствующей возбуждению флуоресценции ГП, приводило к быстрому выходу Ф из клеток за время порядка 25 - 40 секунд, поэтому в дальнейшем изучалась динамика цитоплазматического рН после кратковременного (5 сек.) облучения клеток светом с длиной волны 400 нм. В этом случае динамика внутриклеточного рН фактически отражает способность клеток вернуться после облучения к исходному значению рН. Анализировалась зависимость величины рН, равной разности значений рН до облучения с длиной волны 400 нм и сразу после облучения от времени предварительной темновой инкубации с ГП (То). Было выявлено различие зависимости рН от То для клеток СПЭВ и HeLa. Для малых То (порядка 1 часа) реакцией клеток обеих культур на облучение является снижение pH цитоплазмы примерно на 0,2 pH. При увеличении То до 6 часов для клеток HeLa характерной реакцией становится увеличение рН цитоплазмы до щелочных значений, а для клеток СПЭВ – по прежнему снижение цитоплазматического рН примерно на 0,2 pH. Известно, что снижение рН цитоплазмы клеток является неспецифической реакцией клеток на внешние воздействия, призванной обеспечить стабильность ее мембран. Следовательно, анализ рН показал значительную зависимость от времени предварительной инкубации с ГП, что поднимает вопрос о важности темновой токсичности сенсибилизатора. Было показано, что фотодинамическое действие снижает способность раковых клеток поддерживать стабильную величину цитоплазматического рН. в то время как клетки СПЭВ значительно более устойчивы по отношению к фотодинамическому действию.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1] Хуршилова З.А. и др. //Вестн. Моск. Ун - та. Сер.З 1986. Т. 27, N 5.
[2] Литинская Л.Л. и др. /Щеп. ВИНИТИ.