Известно, что развитию и прогрессированию пролиферативного процесса в заднем полюсе глаза способствуют интравитреальные и периретинальные кровоизлияния [2]. Среди форменных элементов крови, поступающих при этом в полость глазного яблока, наибольший интерес, по нашему мнению, представляют мононуклеары.
Важнейшим свойством мононуклеаров, отличающим их от конечных элементов дифференцировки других гемопоэтических линий, является функциональная полипотентность [4, 5]. Попадая в определенное микроокружение, мононуклеары адаптируются к среде их будущего обитания, факторы которой оказывают модулирующее влияние как на поверхностные свойства клеток, так и на процессы их жизнедеятельности. Возможно, одним из подобных локальных факторов является однонаправленное движение внутриглазной жидкости в полости глазного яблока, создаваемое градиентом давления [3].
Нами разработан новый способ культивирования мононуклеаров крови in vitro, характеризующийся значительным сходством с природой и сущностью происходящих при кровоизлияниях в полость глазного яблока процессов, когда после адгезии к фибриллам стекловидного тела мононуклеары оказываются на пути движения внутриглазной жидкости. Устройство представляет собой замкнутую систему с камерой, в которой находится полупроницаемый фильтр. Система предварительно заполнялась с помощью емкости питательной средой, содержащей 80% среды Mc Coy 5A, 20% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицин. Мононуклеары периферической крови, взятой из локтевой вены здорового донора-добровольца, изолировали с помощью градиента фиколл-верографин.
Клеточный материал вводили в камеру с помощью шприца через клапанное отверстие в ее боковой части. Камера соединялась с емкостью, содержащей питательную среду, через роликовый насос. После включения роликового насоса в сеть в замкнутой системе благодаря его работе создавалось равномерное однонаправленное движение питательной среды со скоростью 4+/-1 см3/мин.
Первичную клеточную культуру инкубировали при постоянном движении жидкой питательной среды с соблюдением условий культивирования. В качестве контроля изучаемые клетки культивировали на полупроницаемом фильтре, помещенном в чашку Петри с необходимой питательной средой, при строгом соблюдении температурного режима (37° С), содержания СО2 (5-7%) и уровня влажности (100%).
Длительность культивирования составила 24, 48 и 72 часа. По окончании экспериментов полупроницаемый фильтр извлекали из системы, клеточный материал исследовали с помощью цитохимических методов.
В процессе культивирования мононуклеаров периферической крови in vitro в условиях направленного движения питательной среды получены следующие результаты.
Спустя 24 ч от начала эксперимента колонии клеток на фильтре были представлены прочно адгезированными к субстрату клетками округлой формы, с крупным, бобовидным или круглым ядром, иногда с зубчатым впячиванием. Цитоплазма базофильная в виде узкого ободка. Цитохимически в клетках отмечалась высокая активность а-нафтилацетатэстеразы, которая блокировалась фторидом натрия. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась.
Спустя 48 ч от начала эксперимента в описываемых клетках также отмечалась высокая активность а-нафтилацетатэстеразы. Однако при проведении реакции с фторидом натрия на фильтре обнаруживались единичные клетки, в которых активность данного фермента не подавлялась. Исследование на щелочную фосфатазу в этих клетках выявляло ее умеренную активность. По большинству морфологических параметров (форма клетки, форма и объем ядра, ядерно-цитоплазматическое отношение) указанные клетки относились к малодифференцированным формам.
Спустя 72 ч от начала эксперимента колонии клеток на фильтре состояли, главным образом, из макрофагов с пенистой, содержащей вакуоли цитоплазмой. Ядро почковидной, реже овальной формы, ядерно-цитоплазматическое отношение <1. Среди макрофагов обнаруживались единичные крупных размеров клетки неправильной, преимущественно, веретенообразной формы. Эти клетки были разобщены друг от друга по поверхности фильтра прочими клеточными элементами. Цитохимически в этих клетках отмечалась высокая активность а-нафтилацетатэстеразы, которая не подавлялась фторидом натрия . Активность щелочной фосфатазы в них также была высокой.
При исследовании полупроницаемого фильтра, на котором культивировались клетки, в его структурах выявлялись соединительнотканные волокна в виде тонких длинных тяжей .
В процессе культивирования мононуклеаров периферической крови в стандартных условиях были получены следующие результаты. На протяжении всей серии экспериментов (24, 48, 72 ч) клеточная культура на фильтре была представлена клетками округлой формы, с бобовидным, реже овальным ядром и небольшим объемом цитоплазмы. Ядерно-цитоплазматическое отношение около 1. Клетки обнаруживали высокую активность а-нафтилацетатэстеразы, которая блокировалась фторидом натрия. Реакция на щелочную фосфатазу была отрицательна.
Полученные результаты культивирования мононуклеаров крови in vitro в различных условиях подтверждают предположение о влиянии направленного движения жидкости на морфофункциональное состояние данных клеток и позволяют предложить следующий механизм его реализации.
Источником фибробластичесих клеток, обнаруженных на фильтре при культивировании мононуклеаров крови in vitro в разработанном устройстве, могут быть
циркулирующие в крови мезенхимальные клетки различной степени дифференцировки. Согласно литературным данным [1, 5], 60-80%    циркулирующих     стволовых
клеток находится в состоянии покоя или периоде G0. Вступление в митотический цикл обусловлено сопряжением между воздействующими на клетки сигналами, состоянием клеточной поверхности и внутренним ответом клеток. В качестве сигналов могут действовать факторы роста, гормоны, а также факторы микроокружения.
Одной из основных функций клеточной поверхности и плазматической мембраны является восприятие и передача внешних регуляторных сигналов внутрь клетки. Именно благодаря этому во многом реализуется взаимосвязь между функцией клеточной мембраны, ее проницаемостью и степенью активности процессов внутриклеточного метаболизма. В условиях проводимых нами экспериментов экзогенным сигналом для адгезированных к фильтру мононуклеаров крови является постоянное направленное движение питательной среды.
Можно предположить, что после взаимодействия внешнего сигнала с клеточными рецепторами инициируется каскадный механизм определенных внутриклеточных процессов. Так, например, происходят изменения в структуре связанных с рецепторами мембранных ферментов, катализирующих синтез эндогенных регуляторных молекул [1]. Вследствие этого происходит сдвиг в их концентрации, и клеточная проницаемость изменяется. Далее в стволовой мезенхимальной клетке, находящейся в периоде G0, происходят координированные метаболические и морфологические изменения, в результате чего она приобретает компетентность к прохождению митотического цикла и вступает в период G1. В процессе деления полипотентная стволовая клетка коммитируется, т.е. становится детерминированной. Коммитирование клеток мезенхимальной природы, как и стволовых кроветворных клеток, по всей видимости, имеет стохастический (вероятностный) характер. Осуществляется оно либо постепенным ограничением дифференцировочных потенций, либо путем выбора одного из возможных направлений дифференцировки [1].
Детерминированное состояние необратимо, и образующиеся клетки-предшественники не способны переходить в период покоя. Данные клетки обладают морфологическими, цитохимическими или иными признаками превращения в зрелые клеточные формы.
Как известно, дифференцировка - это качественный процесс, связанный с изменением экспрессии генов, репрограммированием генома [1]. Возможно,
адгезированные к фильтру клетки-предшественники, находясь на пути движения питательной среды, претерпевают серию модификационных трансформаций, в ходе которых
проявляется активность разных ферментных систем. Изменения внутриклеточного гомеостаза и гомеокинеза, в свою очередь, сопряжены с процессами блокирования-
деблокирования различных наборов генов на субклеточном уровне. Активация генов, кодирующих образование клеточных структур, специфичных для фибробластической
популяции, и обеспечивает переход к цитодифференцировке. Естественно, что происходящие в клетках процессы составляют сложную комбинацию взаимосвязанных
явлений, где преобладают не линейные, а вероятностные закономерности.    В результате, клетки-предшественники фибробластов при постоянном модулирующем
влиянии факторов микроокружения дифференцируются в зрелые формы, продуцирующие коллаген.
Таким образом, результаты культивирования мононуклеаров крови in vitro в условиях направленного движения жидкости позволили существенно расширить представления о фиброгенном потенциале исследуемых клеток.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых ученых
№ МК-2697.2003.04