Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, Новосибирск

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2006 год, Том 3, выпуск 4), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Микроядерный тест широко используются при различных цитологических [8; 23] и гистологических [33; 36; 43] исследованиях. Выявление микроядер в клетках применяется в клинической практике для диагностики ряда заболеваний [8; 24], и при проведении экспериментальных работ [19; 20; 40; 37; 38].
Обнаружение таких структур (часто встречающихся при различных заболеваниях) позволяет использовать их в качестве маркера патологических изменений в организме [8; 24], а наибольшая информативность результатов достигается путем предварительной инкубации клеток in vitro [39].
Известно, что микроядра представляют собой небольшие образования, состоящие из фрагментов хромосом [24]. Нарушение митотического деления влечет за собой потерю части генетического материала, и морфологически выражается в формировании микроядер [8]. Крупные микроядра формируются при патологических митозах, что обусловлено отставанием отдельных хромосом в метафазе и в анафазе, в то время как мелкие микроядра встречаются преимущественно при структурных аберрациях хромосом [5]. Кроме того, микроядра могут появляться в следствие апоптоза [43]. Указанные процессы свидетельствуют о снижении жизнеспособности клеток, что является маркером не стабильности их функционирования [8; 43].
Многие виды излучения, включая рентгеновское [22], гамма излучение [28; 29], облучение фотонами и нейтронами [17], ультрафиолетовое [21] и тепловое излучение [34], а также световое [42; 30], индуцируют формирование микроядер в клетках.
Широкое использование светового излучения при проведении лечебных процедур и его роль в процессах злокачественной трансформации клеток определяет актуальность исследований, направленных на выявление микроядер при воздействии данного физического фактора.
Поскольку фототоксический эффект обусловлен действием свободных радикалов, то ультрафиолетовое излучение может индуцировать образование микроядер [35]. Согласно литературным данным этот вид излучения способствует значительному увеличению численности указанных структур в клетках [41]. При обобщении большого количества результатов исследований было показано, что влияние ультрафиолетового излучения на клетки влечет появление микроядер и хромосомных аберраций, обусловленных действием фотоэффекта [21].
Воздействие света видимого диапазона может при определенных обстоятельствах (в условиях повышенной инсоляции) приводить к образованию микроядер в клетках дермы в следствии оксидативного повреждения [31].
Процесс образования микроядер в результате светового воздействия значительно активируется в случае применения фотодинамических веществ [44; 42]. Известно, что препараты, обладающие фотосенсибилизирующим действием, способствуют (после светового облучения клеток) развитию цитотоксического эффекта, изменяют активность клеточной пролиферации и вызывают повреждение ядра клетки, а это влечет за собой формирование микроядер [44].
Возможный механизм влияния света на клетку связан с тем, что фотоны взаимодействуют с акцепторами световой энергии [15], которыми являются ферменты, участвующие в окислительно-востановительных процессах [2; 3]. В литературе рассматривается несколько механизмов фотобиологического действия, которые включают активацию ферментов [2; 3] и изменение заряда белков, что оказывает воздействие на транспорт различных веществ в клетках [4]. Функциональная активность клеток зависит от спектра излучения [40].
Фотодинамическое влияние красного света индуцирует появление микроядер и активирует процесс апоптоза [30]. Интенсивность протекания данных процессов вариабельна у клеток различного происхождения, при этом атипичные клетки обладают меньшей резистентностью к действию физических факторов, чем интактные, что обусловливает активное формирование микроядер [30].
В то же время, практически не существует достоверных сведений об индукции образования микроядер после облучения клеток синим светом. Однако изменение митотической активности в результате действия световой волны указанного диапазона [6] свидетельствует о нарушении этого процесса, что обычно предшествует формированию микроядер [8].
Влияние факторов идентичных по своей природе и интенсивности воздействия может вызывать не равнозначное увеличение количества микроядер, что зависит, прежде всего, от происхождения клеток [39], и объясняется их различной резистентностью.
Распространение воспалительных заболеваний соединительной ткани [11], и гранулематозных болезней [1; 32], часто имеющих фиброзные осложнения указывает на ухудшение эпидемиологической обстановки в отношении этой патологии [11; 10; 13; 16], и связано с недостаточной эффективностью существующих методов коррекции.
Реакции воспаления составляют основу болезней соединительной ткани [14]. Однако механизм активации нормальной фибропластической регенерации остается до конца не изученным [14], а традиционные представления о фиброзировании ткани как о конечной точке патологического процесса заменяется современной концепцией о потенциально обратимом явлении [27], что не может не привлекать внимания исследователей, занимающихся разработкой методов лечения и профилактики заболеваний, в основе которых лежит избыточное развитие соединительной ткани.
Одним из наиболее актуальных вопросов является лечение пациентов с гранулематозными болезнями и воспалительными заболеваниями соединительной ткани, имеющими поверхностную локализацию [1; 18; 25]. Для этой цели применяются различные фотостимуляторы [9; 12], поскольку действие света на фибробласты изменяет пролиферативную активность клеток [45] и объем синтеза коллагена [26].
Открытым остается вопрос о связи между интенсивностью клеточной пролиферации и характером образования микроядер при световом воздействии. Решение этой проблемы позволило бы моделировать указанные процессы в клеточной культуре для получения результатов, которые целесообразно использовать для разработки эффективных и патогенетически обоснованных методов коррекции и профилактики фиброзных осложнений.
В нашем исследовании для облучения клеток был выбран свет синего диапазона, поскольку не существует убедительных данных, указывающих на изменение количества микроядер в клетках после облучения светом, имеющим эту длину волны. Однако подавление митотической активности синим светом позволяет судить о нарушении данного процесса в целом [6]. Несомненно, что решение вопроса о влиянии света синего спектрального диапазона (оппозитного красному) при отсутствии применения препаратов с фотодинамическим эффектом значительно расширит наши представления о фундаментальных аспектах светотерапии. Кроме того, отсутствует единое мнение о связи между интенсивностью образования микроядер и активностью митотического процесса [7].
Исходя из вышеизложенного, целью исследования являлось изучение влияния света синего диапазона на изменение митотической активности и на характер формирования микроядер в фибробластах, инкубируемых in vitro.
Клетки инкубировали в термостате при температуре 37 С. Исходная концентрация посадки составляла 100 тыс. клеток культуры фибробластов в 1 мл взвеси. Препараты фиксировали 50 % раствором этанола и окрашивали азур – эозином. Результаты оценивали на 48 часов инкубации кле¬ток. Опытная группа была представлена культурами, облучаемыми в течение 48 часов. Световое воздействие начинали одновременно с началом инкубации. В качестве источника излучения были выбраны светодиоды, имеющие синий цвет свечения. Данные приборы потребляли постоянный ток напряжением 3 В, их мощность составляла 1,5 Вт. Сила свечения соответствовала 8 кд.
Определяли содержание фибробластов, имевших в своем составе микроядра. Подсчитывали количество клеток в состоянии митоза. Контролем служили интактные культуры клеток на 24 и 48 часов инкубирования. Все изменения описаны относительно контроля.
Общее количество клеток, содержащих микроядра увеличивалось в интактных культурах на 25 % через 48 часов инкубации по сравнению с исходным уровнем (на 24 часа).
Подавляющее большинство клеток с микроядрами имело единичные структуры крупных размеров во всех группах культур на все сроки экспозиции.
Облучение синим светом индуцировало повышение численности фибробластов с микроядрами на 45,5 % и на 27,3 % по сравнению с параметрами интактных культур, соответственно на 24 и на 48 часов инкубации. На 48 часов экспозиции в культурах, облученных синим светом, численность клеток в состоянии митоза снижалась на 50 % по сравнению с контрольным значением.
Таким образом, после облучения синим светом наблюдалось увеличение количества фибробластов, содержащих микроядра, что происходило на фоне снижения митотической активности клеток.
Из вышеизложенного следует, что микроядерный тест представляет собой высокоинформативный диагностический метод, который широко используется в прикладных и теоретических исследованиях. Формирование микроядер является следствием хромосомных аберраций, патологического течения митотического процесса и результатом апоптоза.
Данный морфологический признак указывает на нарушение стабильного функционирования клеток, что наблюдается, в том числе, и при воздействии на них различных видов излучения. При этом такие факторы, как длина волны, время экспозиции и тип облучаемых клеток играют существенную роль в интенсивности образования микроядер. Ряд исследований влияния многих видов излучения был проведен на атипичных клетках, которые, как известно менее устойчивы к действию указанных физических факторов, а полученные результаты широко применяются в различных областях медицины.
Однако значительный интерес представляет процесс формирования микроядер в клетках в результате светового излучения, что объясняется его повсеместным влиянием на живые организмы и возможностью приводить к индукции онкологических заболеваний при повышенной инсоляции, а также доступностью этого вида излучения для проведения физиотерапевтических процедур.
Согласно литературным данным, наиболее вероятный механизм действия светового излучения на клетку обусловлен взаимодействием фотонов с такими акцепторами световой энергии, как ферменты, контролирующие окислительно-восстановительные процессы. Причем спектр излучения в значительной мере обусловливает вектор и интенсивность протекания внутриклеточных процессов. Активность формирования микроядер во многом определяется не только временем экспозиции и силой светового излучения, но и его спектром.
Учитывая актуальность задачи разработки методов лечения больных с фиброзными осложнениями при воспалении, была предпринята попытка моделирования управления процессом развития клеток соединительной ткани.
Согласно результатам нашего исследования снижение числа клеток с проявлением митотической активности и увеличение количества фибробластов с микроядрами свидетельствует о том, что синий свет подавляет и нарушает процесс митоза. Это, вероятно, связано с определенной способностью световой волны данного диапазона изменять активность ферментов, участвующих в митотическом процессе.
Таким образом, результаты проведенного исследования могут быть применены при дальнейшей разработке моделей регулирования развития клеток соединительной ткани in vitro и in vivo, что в конечном итоге будет способствовать созданию методов адекватного управления процессом фиброзирования ткани, направленных на коррекцию и профилактику фиброзных осложнений при воспалительных заболеваниях различного генеза.

Список литературы:

1. Васильев А.В., Гришко А.Н. Аспекты эпидемиологии // Внелёгочный туберкулёз. СПб., 2000. - С.11-33.
2. Владимиров Ю.А. Три гипотезы о механизме действия лазерного облучения на клетки и организм человека. В сб. Эфферентная медицина М:ИБМХ РАМН, 1994. - С. 51-67.
3. Горбатенкова Е.А., Владимиров Ю.А., Парамонов Н.В., Азизова О.А. Красный свет гелий-неонового лазера реактивирует супероксиддисмутазу // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1989. - Т. 57. - С. 302-305.
4. Егоров С.Ю., Таубер А.Ю., Красновский А.А., Нижник А.Н., Нокаль А.Ю., Миронов А.Ф. Фотогененрация синглетного молекулярного кислорода компонентами производного гематопорфирина.// Бюлл. эксп. биол. мед. - 1989 - Т.108. - №10. - С.440-442.
5. Захидов С.Т., Гопко А.В., Семенова М.Л., Михалева Я.Ю., Макаров А.А., Кулибин А.Ю Карнозин как фактор, модифицирующий частоту встречаемости генетически аномальных половых клеток в семенниках ускоренно стареющих мышей SAM // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134. - № 7.- С. 89.
6. Ильин Д.А Влияние синего света на митотическую активность фибробластов // Естествознание и гуманизм. Томск, 2006. - т.3. - № 2. - С. 20-21.
7. Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Ванчугова Н.Н., Ильинских И.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая не стабильность. - Томск: Изд-во. Том. ун-та, 1992. - 272 с.
8. Калаев В.Н., Буторина А.К., Кудрявцева О.Л. Частота встречаемости клеток с микроядрами в плоском эпителии, полученном из соскобов с шейки матки женщин детородного возраста при различных физиологических состояниях, в норме и при воспалении // Естествознание и гуманизм - 2006. - Т. 3. - № 2. - С. 22-23.
9. Кару Т.Й. Фотобиология низкоинтенсивной лазерной терапии // Итоги науки и техники. Физические основы лазерных и пучковых технологий.-1989.- Т.4.- С.44-84.
10. Ковалева С.И. Особенности  эпидемиологии туберкулеза в Москве и меры по ее улучшению. // Пробл. туб. – 1994. – № 5. – С. 2–4.
11. Насонова В.А., Астапенко М.Г. Клиническая ревматология. - М.: Медицина, 1989.- 592 с.
12. Плетнев С.Д. Лазеры в клинической медицине. - М.: Медицина, 1996.-432 с.
13. Рыбка Л.Н., Пунга В.В.  Туберкулез  у беженцев из дальнего зарубежья // Пробл. туб. – 1996. – № 3. – С. 12–13.
14. Сигидин Я.А., Гусева Н.Г., Иванова М.М. Диффузные болезни соединительной ткани. - М.: Медицина, 1994.- 544 с.
15. Утц С.Р., Волнухин В.А. Низкоинтенсивная лазеротерапия в дерматологии. Саратов. Изд-во Саратовского Ун-та, 1998. - 92 с.
16. Хоменко А. Г.  Туберкулез  сегодня и завтра – проблемы и пути решения // Пробл.туб. – 1995. – № 1. – С. 4–8.
17. Akudugu J.M., Binder A., Serafin A., Slabbert J., Giese A., Bohm L. Changes in G1-phase populations in human glioblastoma and neuroblastoma cell lines influence p66/Be neutron-induced micronucleus yield // Life. Sci. - 2004. - V. 75. - № 5. - P. 623-632.
18. Alcais A., Sanchez F.O., Thuc N.V., Lap V.D., Oberti J., Lagrange P.H., Schurr E., Abel L. Granulomatous reaction to intradermal injection of lepromin (Mitsuda reaction) is linked to the human NRAMP1 gene in Vietnamese leprosy sibships // J. Infect. Dis. - 2000. - V. 181. - № 1. - P. 302-308.
19. Balansky R.B., D'Agostini F., Zanacchi P., De Flora S. Protection by N-acetylcysteine of the histopathological and cytogenetical damage produced by exposure of rats to cigarette smoke // Cancer. Lett. - 1992. - V. 64. - № 2. - Р. 123-131.
20. Balansky R.M., D' Agostini F., De Flora S. Induction, persistence and modulation of cytogenetic alterations in cells of smoke-exposed mice // Carcinogenesis. - 1999. - № 8. - Р. 1491-1497.
21. Brendler-Schwaab S., Czich A., Epe B., Gocke E., Kaina B., Muller L., Pollet D., Utesch D. Photochemical genotoxicity: principles and test methods. Report of a GUM task force // Mutat. Res. - 2004. - V. 566. - № 1. - P. 65-91.
22. Cerqueira E.M., Gomes-Filho I.S., Trindade S., Lopes M.A., Passos J.S., Machado-Santelli G.M. Genetic damage in exfoliated cells from oral mucosa of individuals exposed to X-rays during panoramic dental radiographies // Mutat. Res. - 2004. - V. 562. - № 1-2. - P. 111-117.
23. Chinnasamy N., Rafferty J.A., Hickson I., Ashby J., Tinwell H., Margison G.P., Dexter T.M., Fairbairn L.J. O6-benzylguanine potentiates the in vivo toxicity and clastogenicity of temozolomide and BCNU in mouse bone marrow // Blood. - 1997. - V. 89. - № 5. - Р. 1566-1573.
24. El-Zein R.A., Schabath M.B., Etzel C.J., Lopez M.S., Franklin J.D., Spitz M.R. Cytokinesis-blocked micronucleus assay as a novel biomarker for lung cancer risk // Cancer. Res. - 2006. - V. 66. - № 12. - Р. 6449-6456.
25. Fauci A., Haynes B., Katx P. The spectrum of vasculitis // Ann. Int. Med. - 1978. - V. 89. - P. 600-676.
26. Funk J.O., Kruse A., Kirchner H. Cytokine production after helium-neon laser irradiation in culture of human peripheral blood mononuclear cells // J. Photochem. Photobiol. - 1992 -V.16. № 3. - P. 347-355.
27. Gabbiani G. The cellular derivation and the life span of the myofibroblast // Pathol. Res. Pract. - 1996. - V. 192. - № 7. - P. 708-711.
28. Godderis L., Aka P., Mateuca R., Kirsch-Volders M., Lison D., Veulemans H. Dose-dependent influence of genetic polymorphisms on DNA damage induced by styrene oxide, ethylene oxide and gamma-radiation // Toxicology. - 2006. - V. 219. - № 1-3. - Р. 220-229.
29. Goel H.C., Agrawala P.K., Pathania V., Malhotra N. Immunomodulatory and cytoprotective role of RP-1 in gamma-irradiated mice // Mol. Cell. Biochem. - 2003. - V. 254. - № 1-2. - Р. 73-81.
30. Gupta S., Dwarakanath B.S., Muralidhar K., Jain V. Cellular uptake, localization and photodynamic effects of haematoporphyrin derivative in human glioma and squamous carcinoma cell lines // J. Photochem. Photobiol. B. - 2003. - V. 69. - № 2. - P. 107-120.
31. Hoffmann-Dorr S., Greinert R., Volkmer B., Epe B. Visible light (>395 nm) causes micronuclei formation in mammalian cells without generation of cyclobutane pyrimidine dimers // Mutat. Res. - 2005. - V. 572. - № 1-2. - P. 142-149.
32. Jinnouchi K., Terasaki Y., Fujiyama S., Tomita K., Kuziel W.A., Maeda N., Takahashi K., Takeya M. Impaired hepatic granuloma formation in mice deficient in C-C chemokine receptor 2. // J. Pathol. - 2003. - V. 200. - № 3. - Р. 406-416.
33. Lahiri T., Roy S., Basu C., Ganguly S., Ray M.R., Lahiri P. Air pollution in Calcutta elicits adverse pulmonary reaction in children // Indian. J. Med. Res. - 2000. - V. 112. - Р. 21-26.
34. Masunaga S.I., Ono K., Suzuki M., Kinashi Y., Takagaki M., Hori H., Kasai S., Nagasawa H., Uto Y. Usefulness of tirapazamine as a combined agent in chemoradiation and thermo-chemoradiation therapy at mild temperatures: reference to the effect on intratumor quiescent cells // Jpn. J. Cancer. Res. - 2000. - V. 91. - № 5. - P. 566-572.
35. Moller M., Adam W., Marquardt S., Saha-Moller C.R., Stopper H. Cytotoxicity and genotoxicity induced by the photochemical alkoxyl radical source N-tert-butoxypyridine-2-thione in L5178Y mouse lymphoma cells under UVA irradiation // Free. Radic. Biol. Med. - 2005. - V. 39. - № 4. - P. 473-482.
36. Moore F.R., Urda G.A., Krishna G., Theiss J.C. An in vivo / in vitro method for assessing micronucleus and chromosome aberration induction in rat bone marrow and spleen. 1. Studies with cyclophosphamide // Mutat. Res. - 1995. - V. 335. - № 2. - Р. 191-199.
37. Moore F.R., Urda G.A., Krishna G., Theiss J.C. An in vivo/in vitro method for assessing micronucleus and chromosome aberration induction in rat bone marrow and spleen. 2. Studies with chlorambucil and mitomycin C // Mutat. Res. - 1995. - V. 335. - № 2. - Р. 201-206.
38. Nishikawa A., Furukawa F., Kasahara K., Ikezaki S., Itoh T., Suzuki T., Uchida K., Kurihara M., Hayashi M., Miyata N., Hirose M.Trans-4-hydroxy-2-nonenal, an aldehydic lipid peroxidation product, lacks genotoxicity in lacI transgenic mice // Cancer Lett. - 2000. - V. 148. - № 1. - Р. 81-86.
39. Norppa H., Luomahaara S., Heikanen H., Roth S., Sorsa M., Renzi L., Lindholm C. Micronucleus assay in lymphocytes as a tool to biomonitor human exposure to aneuploidogens and clastogens // Environmental Health Perspectives Supplements. - 1993. - V. 101. - № 3. - P. 139-143.
40. Sroka M., Schaffer P.M., Duhmke E., Baumgarter R. Еffects on the mitosis of normal and tumor cells induced by light treatment of different walengths // Laser Surg. Med. - 1999 -V.25, N 3.Pp.-263-271.
41. Valovicova Z., Gabelova A. Effect of cytosine arabinoside and hydroxyurea on micronucleus formation induced by model clastogens in Chinese hamster V79 cells // Neoplasma. - 2004. - V. 51. - № 6. - P. 442-449.
42. Villanueva A., Juarranz A., Diaz V., Gomez J., Canete M. Photodynamic effects of a cationic mesosubstituted porphyrin in cell cultures // Anticancer Drug Des. - 1992. - V. 7. - № 4. - P. 297-303.
43. Voitovich A.M., Afonin V.Y., Krupnova E.V., Trusova V.D., Dromashko E.S. The level of aberrant cells in various tissues of bank vole depending on doses and radionuclide balance in organism // Tsitol. Genet. - 2003. - V. 37. - № 4. - Р.10-15.
44. Ward A.J., Matthews E.K. Cytotoxic, nuclear, and growth inhibitory effects of photodynamic drugs on pancreatic carcinoma cells // Cancer Lett. - 1996. - V. 102. - № 1-2. - P. 39-47.
45. Webb C., Dyson M., Lewis W.H. Stimulatory effect of 660 nm low level laser energy on hypotrophyc scar-derived fibroblasts: possible mechanisms for increase in cell counts // Laser Surg. Med. -1998. - V.22. - № 5.- P.294-301.