Ильинских Е.Н., Новицкий В.В., Ильинских И.Н., Романова М.В., Семенов А.Г.
Сибирский государственный медицинский университет (г.Томск)

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

      При  морфологическом изучении   хроматина интерфазного ядра следует выделять два уровня организации:
1. молекулярный уровень, исследуемый преимущественно методами электронной микроскопии;
2. надмолекулярный уровень изучаемый, в основном, на светооптическом уровне.
 Структура интерфазного ядра, определяемая визуально, представляет собой чередование светло и темноокрашенных участков. Светлые соответствуют участкам диффузного хроматина, а темные - конденсированного (Ченцов Ю.С., 1976;  Мантейфель В.М., 1977;  Босток К., Самнер Э., 1981).
К ДНК-содержащим гранулярным структурам относят:
- примембранный хроматин - это конденсированный хроматин, непосредственно контактирующий с ядерной мембраной, расположенный в виде отдельных гранул или протяженных скоплений (Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С., 1971). Предположительно гранулярный слой периферического хроматина выполняет  функцию ядерного каркаса и фиксирует фибриллы ДНП на внутреней ядерной мембране (Ченцов Ю.С., 1984), по-видимому,  лизис этого слоя, часто наблюдаемый  нами под влиянием различных инфекционных факторов одна из причин изменения формы ядра.
- перинуклеарный хроматин представляет собой несколько зон уплотнений хроматина (гранул), прилежащих к ядрышку. Он представлен материалом ядрышкового организатора хромосом (Прокофьева-Бельговская А.А., 1977). Изменения  этого участка ядра регистрируется в наших экспериментах при стрептококковой инфекции (Ильинских Н.Н. и др., 1972, 1978, 1984, 1990, 2000), когда отчетливо видны скопления микробов в зоне окружающей ядрышко, что сопровождается  на хромосомном уровне изменениями  ассоциативной активности ядрышкообразующих хромосом, а также 1 и 11 хромосом. Имеются данные (Lichter P. et al., 1991) свидетельствующие о том, что район хромосомы 1р12 расположен вблизи ядрышка, а  теломерный район 11qter располагается внутри ядрышка.
свободный конденсированный хроматин представляет собой зоны разбросанные по всему ядру. По литературным данным, этот хроматин  состоит из конститутивного гетерохроматина теломерных, центромерных и околоцентромерных участков хромосом (Томилин В.Н., 1983). Как свидетельствуют полученные нами данные именно в этих участках и локализуется большая часть наблюдаемых структурных нарушений хромосом.
   Поскольку  расположение хромосом в интерфазном ядре строго упорядоченно, то закономерно возникает предположение, что структурные аберрации хромосом, а тем более изменения в числе хромосом должны накладывать отпечаток на  изменение морфологии интерфазного ядра.  Из- ряда работ (Спитковский Д.М., 1979; Федорова К.Н., 1982; Юдина И.Э. и соавт., 1984) известно, что при различных патологиях, сопровождающихся регулярными и нерегулярными нарушениями в числе и структуре хромосом (синдром Дауна, фенилкетонурия, системная красная волчанка, шизофрения, синдром Шерешевского-Тернера) изменяется надмолекулярная организация хроматина в клетках, в частности в лимфоцитах крови (Calabretta, Saunders, 1983).
   Клинико-цитологические исследования показали, что ухудшение состояния организма сопровождается нарастанием степени гетрохроматизации ядер, тогда как при выздоровлении или улучшении состояния увеличивается количество ядер с нежной сетью деконденсированного хроматина (Дашлова В.Д.  с соавт. 1975). Установлено, при этом, что процессы конденсации и деконденсации хроматина лимфоцитов связаны с присутствием в плазме крови генотоксических агентов
   Корреляционный анализ свидетельствует, что под влиянием самых различных инфекционных агентов имеется связь между такими показателями как размер ядрышка, митотическая активность и ассоциативная активность акроцентрических ядрышкообразующих хромосом. Согласно А.К. Фролова (1993) этот феномен обусловлен тем, что блокирование  инфекционным агентом клеток в интерфазе дает возможность акроцентрическим хромосомам сблизиться и сформировать ядрышко, что способствует усилению биосинтеза белка в инфицированной клетке.
   Согласно данным представленным Я.Е.Хесиным (1967) под воздействием вирусов в условиях культуры клеток первая, сравнительно непродолжительная в данном случае кариопатоглогическая реакция занимает приблизительно 2 часа и наблюдается непосредственно после адсорбции вируса на клетках. Эта реакция характеризуется статистически достоверным уменьшением размеров ядер и ядрышек, которая достигает максимума после адсорбции вируса. Затем эти различия между размерами ядер и ядрышек клеток инфицированных и контрольных культур начинают сглаживаться и примерно через 1,5 часа после адсорбции вируса становятся незначительными. На том же раннем этапе инфекции в резко уменьшенных ядрах появляется увеличенное по сравнению с контрольной культурой число ядрышек. Параллельно с этими изменениями на первых этапах инфекции цитохимическим методом (окраска метиленовым синим в разных зонах рН фосфатного буфера, по Шабадашу) выявляется отчетливое снижение реакции на рибонуклеопротеиды (РНП) ядрышка и кариоплазмы. Одновременно резко усиливается реакция на РНП околоядрышкового хроматина, в частности вокруг вновь образовавшихся ядрышек.  В дальнейшем после адсорбции вируса в клетках культур начинает проявляться вторая реакция, выражающаяся в увеличении размеров ядер и ядрышек. Это увеличение сначала незначительно, но постепенно усиливается. Таким образом, при вирусной инфекции наблюдается совершенно определенная динамика изменения размеров ядер и ядрышек. В это же время обнаруживаются и значительные изменения в содержании и распределении рибонуклеопротеидов ядерного аппарата клетки: отшнуровывание зерен и более крупных скоплений РНП от околоядрышкового хроматина, перемещение их в пределах кариоплазмы в сторону оболочки ядра. Изменения ядерного аппарата, впервые проявляющиеся через несколько часов после заражения и связанные, видимо, со стимуляцией синтетических процессов, сохраняются и даже несколько усиливаются на более поздних этапах инфекции, когда происходит интенсивная репродукция вируса. Однако уже через 24 часа после заражения, задолго до гибели клеток, которая в данном случае происходила через 48—72 часа, наблюдается ослабление реакции на РНП ядрышка, околоядрышкового хроматина и кариоплазмы, что должно быть истолковано как прекращение процессов, обеспечивающих стимуляцию синтеза в связи с повреждением ядерных структур. Существенные изменения ядра и его компонентов отмечаются на более поздних стадиях вирусной инфекции, при развитии так называемого цитопатического эффекта, приводящего клетку к гибели. В этом случае при воздействии ряда вирусов можно отметить перемещение хроматина к внутренней поверхности ядерной оболочки - маргинацию, потерю ядром тургора, сморщивание, кариорексис и кариопикноз. Я.Е. Хесин (1967) полагал, что это явление не связано с  повреждением генома клетки. Поскольку эти изменения после введения инфекционного агента наступают очень быстро мы также полагаем, что наблюдаемая кариопатология в ранние сроки инфекционного процесса не являются результатом нарушений в числе и структуре хромосом, в то же время наши данные позволяют считать (Ильинских Н.Н. и др., 1972, 1978, 1984, 1990, 2000), что повышение числа таких клеток в условиях in vitro сопровождается резким увеличением патологических митозом, моносомий и хромосомных аберраций, по-видимому, грубые поражения интерфазного ядра, несомненно заканчивающиеся гибелью клетки, не приводят к цитогенетическим нарушениям, а менее разрушительные изменения могут инициировать  нарушения в структуре и числе хромосом и в  протекании митоза. Показано, что на поздних сроках заражения (72 часа) увеличение числа полиплоидных клеток сопровождается параллельным увеличением числа клеток с крупными ядрами, появление клеток с ядами малых размеров - нарушениями в протекании митоза и гипоплоидией, а клеток с кариолизисом - структурными нарушениями и моносомиями.
   Токсины многих видов бактерий после ведения в культуру клеток человека тормозят синтез ДНК и белка и разрушают пучки прямых актиновых филаментов, блокируют митоз на стадии метафазы (Thelestam М., Bronnegard М., 1979; Xiong M. et al., 2001; Hara-Kudo Y. et al., 2001). Поражение ядерных структур под влиянием бактерий, по-видимому, в некоторых случаях обусловлено нуклеазами, присутствующими во многих микробах (Калиниченко Н.Ф.и др., 1968; Chen T.R. et al., 2001). Нуклеазы играют значительную роль в патогенезе бактериальных инфекций (Кузьмиченко И.А.,1979  Езепчук Ю.В.,1988; Супотницкий М.В.,2000; Schnerr H. et al., 2001 ). При большинстве инфекционных заболеваний бактериальной этиологии отмечаются значительные изменения в нуклеиновом обмене, что также может способствовать индукции хромосомных нарушений, такие данные имеются относительно туберкулеза (Белоблоцкий Г.А., 1973; Suffys P. et al., 2001) и  ревматизма ( Зборовский А.Б., Чернышев Е.П, 1972; Кан Б.С.,1973), По-видимому, в большинстве случаев влияние бактерий на ядерные структуры опосредовано, хотя некоторые бактерии, как, например, стрептококи, согласно полученным нами данным способны проникать в клетки и располагаться вокруг ядерной оболочки, проникать внутрь ядра и лизировать зону расположенную вокруг ядрышка.
   Согласно данным, представленным Н.Рингерц и Р. Сэвидж (1979), под действием туберкулезного процесса в легких образуются многоядерные клетки, что, по-видимому, обусловлено аномалиями деления клеток, индуцированными микобактериями. Повышенный уровень нарушений отмечен  через 0,3-2 час. после  контакта культуры клеток с туберкулином (Keijman J. et al., 2001). Сразу же после воздействия туберкулина большинство делящихся клеток оказалось со скленными хромосомами, затем стали появляться клетки с рассеиванием хромосом. Резкий подъем аберрантных митозов сопровождался изменением их видового состава. Сенситины вызывали полную остановку митоза на стадии метафазы, а туберкулин подобного действия не оказывал. Все изученные препараты не меняли митотическую активность культуры клеток (Suffys P. et al., 2001).
   Под влиянием микобактерий, токсоплазм и др. агентов в культуре лимфоцитов человека появляются так называемые "леопардовые ядра". Станбридж и др. (Stanbridge Е .et al,1969) предполагают, что появление таких ядер обусловлено блокированием проникновения в ядро клетки предшественников необходимых для биосинтеза ДНК и это обуславливает появление пятнистой окраски. В то же время имеются данные свидетельствующие, что это может быть проявление первых фигур апоптоза ядра, когда срабатывает ген p53 и нуклеазы начинают локальную рестрикцию ДНК, способность которой к окраске основными красителями резко снижается.   Согласно литературным данным (Blackston C.R., 2001; Liesenfeld O et al., 2001)  спорозоиты преобладающего большинства видов рода Eimeria (к которому относятся токсоплазмы) внедрившись в клетку культуры, продвигаются в цитоплазме и располагаются, как правило, в непосредственной близости к ядру; в отдельных случаях паразиты образуют вдавливание или углубление в ядре (Hu S. et al., 2001; Chen G. et al., 2001), а иногда даже проникают в ядро. Некоторые виды эймерий, являющиеся внутриядерными паразитами в естественном хозяине, также внедряются в ядро клетки культуры (Guo H. et al., 2001).  Ядро клетки культуры под влиянием паразита приобретает необычную форму; при этом оно несколько увеличено. В других случаях имеет место также и уменьшение ядра в инвазированной клетке. Как правило, увеличение ядра наблюдается при внутриядерном развитии паразита (Lindsay D.S. et al., 2002). Внедрение более одного, спорозоита в ядро клетки и последующее его развитие, приводит к изменению формы ядра и его вакуолизации. В отдельных клетках можно видеть морфологические изменения, вызванные, скорее всего, механическим повреждением при скоплении большого числа паразитов, - деформацию ядер, образование крупных вакуолей, содержащих и не содержащих токсоплазмы (Ramos Silva J.C., 2001). На поздних сроках инвазии встречаются резко измененные клетки своеобразной формы. Довольно часто в инвазированных культурах наблюдаются картины фрагментации ядер с образованием многочисленных микроядер. Этот феномен неоднократно описывался в клетках культур при некоторых формах вирусной инфекции. Кроме того часто явление формирования двуядерных клеток (Bahnson P.B. et al., 2001; Matsuzaki M. et al., 2001; Hafid J. et al., 2001).
   Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при токсоплазменной инфекции в условиях культуры лимфоцитов наблюдаются многополюсные митозы, что  обусловлено появлением дополнительных центриолей и формированием нескольких ахроматиновых  веретен деления клетки (Sukthana Y. et al., 2001; Schumacher M.A. et al., 2002).  Некоторыми авторами высказывается предположение, что  при инфицировании клетки многоклеточного организма некоторыми простейшими, органоиды паразита, в том числе и центриоли, могут быть «захвачены» клеткой хозяина и включены в процессы  жизнедеятельности. Не исключено, что именно это состояние наблюдается при инфицировании культуры лимфоцитов человека токсоплазмами.
 В культурах клеток зафиксированных через 24 ч после заражения вирусом клещевого энцефалита, отмечается в части клеток небольшое увеличение эозинофилии или пиронинофилии перинуклеарной области (Spinsanti L. et al., 2001). В этих участках на препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым, при люминесцентной микроскопии отмечено увеличение яркости оранжево-красной флюоресценции. Выявлено усиление реакции на общий белок в перинуклеарной области. В клетках с указанными изменениями часто отмечали гипертрофию ядрышек и укрупнение глыбок хроматина. В дальнейшем в этих клетках развивались процессы кариопикноза (Moses H. et al., 2002).
   Согласно литературным  данным (Waku Kouomou D., Wild T.F., 2002)  одним из специфических эффектов вируса кори является образование симпластов, при этом в окрашенных препаратах культур клеток как в ядрах симпластов, так и в ядрах других клеток наблюдаются включения. Они занимают почти все ядро, окружены кольцом хроматина, располагающемся по периферии ядра (del Mar Mosquera M., 2001). При окраске по Фельгену включения не окрашиваются, не выявлена также их связь с антигеном или нуклеиновой кислотой коревого вируса. Появлению внутриядерных включений предшествует изменение структуры ядрышек (Riddell M.A. et al.,2002).  Полученные нами данные действительно свидетельствуют, что вакцинный штамм вируса кори Л-16 в условиях in vitro способен индуцировать появление многоядерных клеток содержащих от 2 до 6 ядер. Цитологи условно приняли считать за симпласт клетки содержащие от 10 и более ядер (Клишов А.А., 1968), клеток с таким числом ядер мы не наблюдали.  По-видимому, возможно заключить, что аттенуация  вакцинного вируса кори (штамм Л-16) привела к снижению его цитопатогенных свойств. Об этом же свидетельствует и то, что мы не зарегистрировали формирования  особых включений в ядрах  лифоцитов в зараженных этим вирусом культурах клеток, а также пониженную способность индуцировать цитогенетические нарушения у вакцинированных детей.