1Логинов С.И., 1Семенова О.Н., 1Илюшина Н.И., 2Куликова С.Г.
1Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (г. Новосибирск)
2Новосибирский государственный аграрный университет

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Ядрышкообразующими районами хромосом (ЯОР) называют участки хромосом, в которых локализованы кластеры рибосомных генов, участвующие в формировании ядрышка [1-3]. Таким образом, обеспечивая синтез рРНК и формирование рибосом, ядрышки являются ответственными за синтез белка в соматических клетках организма животных и растений. Число ядрышек генетически детерминировано и связано с числом ядрышкообразующих хромосом. Известно, что ядрышко весьма лабильный компонент клетки и при определенных физиологических и патологических состояниях организма может либо активироваться (при усилении функции клетки), либо инактивироваться и редуцироваться (при экспериментальных воздействиях и в онтогенезе). Количественное определение ЯОР в интерфазных клетках позволяет судить о пролиферативной активности клеток. Цитогенетический метод избирательной окраски серебром in vivo позволяет выявлять ядрышки в интерфазных ядрах клеток в цитологических препаратах [3].
 Цель исследований – выявить закономерности количественного изменения ядрышковых организаторов в интерфазных ядрах лимфоцитов крови крупного рогатого скота в онтогенезе, при острой форме анаплазмозной инвазии и лейкозе.
Материалы и методы
Исследования по количественному изменению ЯОР в онтогенезе проводили на группах крупного рогатого скота разного возраста, принадлежащего сельхозпредприятию в Томском районе Томской области благополучному по хроническим инфекциям (лейкоз, туберкулез, бруцеллез). Были подобраны 9 групп клинически здоровых животных (телок, коров) по 7 голов в каждой 10-дневного, 1-, 2-, 4-, 6-месячного, 1-, 4-годовалого, 6- и 8-летнего возраста.
Для исследования влияния анаплазмозной инвазии на показатели ЯОР были подобраны две группы коров по 8 голов в каждой: 1) с клиническим острым течением анаплазмоза и 2) контрольная. Исследования проведены в весенний период в сельхозпредприятии Бакчарского района Томской области, неблагополучном по анаплазмозу и лейкозу крупного рогатого скота.
Изучение влияния заболевания лейкозом на количественные показатели ЯОР в интерфазных ядрах лимфоцитов крови у крупного рогатого скота проведено включительно в динамических опытах по изучению цитогенетических и иммунологических последствий вакцинаций против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула. Взяты средние показатели ЯОР по группам коров 3-4 лактации до вакцинаций и спустя 1, 3, 7 дней, 2, 4 и 8 недель после вакцинаций: 1) клинически здоровые коровы из хозяйства благополучного по лейкозу крупного рогатого скота (Новосибирский район Новосибирской области) (10 голов); 2) инфицированные вирусом лейкоза коровы (7 голов) и 3) коровы с изменениями крови, характерными для лейкоза крупного рогатого скота (3 головы) из хозяйства неблагополучного по лейкозу (Коченевский район Новосибирской области).
Мазки крови готовили на предметных стеклах обычным способом. Для выявления ЯОР в интерфазных ядрах лимфоцитов крупного рогатого скота использовали метод окрашивания серебром [3] с незначительными модификациями. Для количественного подсчета ЯОР в каждом мазке анализировали 200 лимфоцитов крови под иммерсией (увеличение 1500). Индекс ЯОР представлен как сумма ядрышек деленная на анализированное число клеток (200).
Для сравнения полученных данных использовали стандартные биометрические методики.
Результаты исследований
Средние значения индексов ЯОР, рассчитанные по разновозрастным группам животных, показывают поступательное снижение показателей с 2,59 ± 0,08 (10-дневные телята) до 2,04 ± 0,04 (8-летние коровы). При этом, начиная с 2-месячного возраста, уровень значимости разницы показателей по сравнению с животными старших групп достоверен (p < 0,05-0,001).
Диапазон колебаний (вариабельность) показателей индекса ЯОР между отдельными животными в группе был незначительным, а коэффициент вариации – в пределах 2,7-8,5%.
Определенный интерес представляют выявленные закономерности распределение лимфоцитов с разным содержанием ЯОР (от 1 до 9 ядрышек) среди анализированных клеток.
С возрастом увеличивается содержание лимфоцитов, имеющих в ядре только одно ядрышко, с 14,2 ± 2,1 до 27,0 ± 2,5% (после 2-месячного возраста разница с животными старших групп достоверна). Модальный класс для животных всех возрастов представлен клетками с 2-мя ядрышками, и количество таких клеток колеблется в пределах 41,0-48,9% с недостоверным повышением с возрастом. Количество лимфоцитов, имеющих от 3 до 7 ядрышек, у крупного рогатого скота с возрастом достоверно снижается. Причем с увеличение частоты ЯОР это снижение резче.
Лимфоциты с 8-ью ядрышками наблюдались редко: 2 клетки у телки 10-дневного возраста и одна – у 4-летней коровы. Кроме того, имел место единичный случай обнаружения лимфоцита с 9 ядрышками у телки 10-дневного возраста.
Исследования животных, инвазированных анаплазмами, показывают, что средние значения индексов ЯОР достоверно повышены в группе клинически больных анаплазмозом: 3,07 ± 0,09 против 2,81 ± 0,06 в контроле, р < 0,05. Диапазон колебаний (вариабельность) показателей индекса ЯОР между отдельными животными в группе и коэффициент вариации были незначительными (2,79-3,62, коэффициент вариации – 8,5% для животных, инвазированных анаплазмами, и 2,62-3,05 и 5,7% соответственно в контроле), однако в группе инвазированных животных они выше.
При анаплазмозной инвазии у крупного рогатого скота имело место повышение содержания лимфоцитов с количеством ядрышек в интерфазном ядре более 4 (до 9) и снижение числа лимфоцитов с 1-3 ядрышками по сравнению с контрольной группой животных.
Сравнительные исследования содержания ядрышек в интерфазных ядрах лимфоцитов в группах клинически здоровых, инфицированных вирусом лейкоза и гематологически больных лейкозом коров показали следующие индексы ЯОР 1,99 ± 0,07; 2,29 ± 0,14 (p > 0,05 по сравнению с клинически здоровыми) и 2,84 ± 0,08 (p > 0,001 по сравнению с клинически здоровыми и p > 0,05 по сравнению с инфицированными) соответственно. В данном динамическом эксперименте, цели которого описаны в «Материалах и методах», ЯОР являлись лишь одним из анализируемых показателей и не были основным объектом исследования. Но следует отметить, что при последующих кровобратиях в динамике подобная тенденция сохранялась при высоком уровне значимости разницы показателей и увеличении среднего значения по группе гематологически больных лейкозом коров до 3,14 ± 0,11, в то время как по группе инфицированных коров показатель был равен 2,24 ± 0,11 (p > 0,001) и по клинически здоровым – 2,06 ± 0,08 (p > 0,001).
Увеличение индекса ЯОР в группе гематологически больных лейкозом коров, как и во всех предыдущих случаях, происходило за счет достоверно пониженного числа лимфоцитов с 1-2 ядрышками и достоверного увеличения количества клеток с 3 ядрышками и более.
Обсуждение
В настоящее время большинство цитогенетических исследований проводится с использованием трудоемких и длительных в исполнении методик, направленных на выявление частоты встречаемости хромосомных нарушений. Кроме того, эти методики основаны на культивировании клеток в условиях in vitro, что не всегда дает совпадающие результаты с условиями in vivo [4]. При этом существуют достаточно информативные цитогенетические методы выявления прижизненных изменений ядер клеток. В частности, количественные и качественные показатели определения структуры ядрышка и ЯОР, являющегося обязательным компонентом клетки и исчезающим только при митозе, отражают общие принципы функционирования хромосом в интерфазном ядре [5].
Как было отмечено выше, число ядрышек генетически детерминировано – это видовой признак, и, например, у человека может быть выявлено в метафазе 20 ЯОР. Однако не все ЯОР активно транскрибируются, и в интерфазных ядрах может быть обнаружено значительно меньшее число активных ЯОР [3, 5].
Выполненные нами исследования по изучению возрастного изменения числа ядрышковых организаторов в интерфазных ядрах лимфоцитов крови крупного рогатого скота показали закономерный процесс обратного развития ЯОР в онтогенезе, связанный со снижением функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Это отразилось в достоверном снижении средних значений индексов ЯОР у крупного рогатого скота с возрастом, а также поступательных изменениях распределения лимфоцитов с разным числом ЯОР, выраженным в увеличении числа клеток с 1-2 ядрышками и их снижении с более чем 3 ядрышками.
Обращает внимание незначительная вариабельность индексов ЯОР между отдельными животными в каждой из анализируемых возрастных групп.
Выявленные количественные изменения числа ядрышковых организаторов в интерфазных ядрах лимфоцитов крови крупного рогатого скота при анаплазмозе свидетельствуют с одной стороны, об интенсификации метаболических процессов в иммунокомпетентных клетках (в этой связи нелишне вспомнить синтез аутоантител и наличие аллергических реакций, присущих данному заболеванию [6]), и, с другой стороны, – о возможном наличии цитогенетических нарушений, что подтверждается обнаруженным нами повышенным количеством эритроцитов с микроядрами в крови инвазированных животных (материал в настоящей статье не представлен). По-видимому, данные изменения способны играть определенную роль в снижении общей резистентности организма и устойчивости животных к сопутствующим заболеваниям на неблагополучной по анаплазмозу территории, в частности лейкозу, болезням бактериальной этиологии.
Исследования, установившие повышенный уровень ЯОР в лимфоцитах при лейкозе крупного рогатого скота, согласуются с опубликованными ранее работами об увеличении индекса ЯОР у коров, инфицированных вирусом лейкоза [7], и у людей, больных гемобластозами различных нозологических форм [3, 8].
По существующим представлениям о структуре и функции ЯОР хромосом предполагается, что они обладают основными свойствами, присущими адаптивным системам, то есть участие в жизненно важных функциях организма. Данное положение было подтверждено как при изучении количества ядрышек в клетках разных видов в процессе филогенетического развития, так и в онтогенезе и при различных патологиях, включая злокачественные новообразования [3, 7-10].
Представленные исследования подтвердили общие закономерности функционирования ЯОР в клетках. Метод окрашивания серебром мазков крови для выявления ЯОР в интерфазных ядрах лимфоцитов крупного рогатого скота может быть применен в клинических и эколого-биологических исследованиях. Более того, ранее была высказана мысль о включении методов по выявлению ЯОР в лимфоцитах в качестве цитогенетического и цитологического тестов в иммунологию, так как имеет место связь частоты ядрышек с уровнем дифференциации лимфоцитов – одноядрышковые лимфоциты представлены зрелыми клетками [11], что требует подтверждения. Данный тест не исключает использование классического метафазного анализа с культивированием клеток in vitro, а наоборот дополняет его.
Выводы
1.    Метод окрашивания мазков крови коллоидным серебром для количественного подсчета ядрышкообразующих районов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов может быть использован для оценки пролиферативной активности клеток.
2.    В ходе онтогенетического развития организма происходит снижение индекса ЯОР в интерфазных ядрах лимфоцитов в результате уменьшения пролиферативных и метаболических процессов в клетках.
3.    Активизация пролиферации лимфоцитов при остром анаплазмозе и лейкозе крупного рогатого скота сопровождается достоверным повышением индексов ЯОР.  
4.    Количественное изменение индексов ЯОР происходит за счет перераспределения лимфоцитов по числу ядрышек либо в сторону увеличения одноядрышковых лимфоцитов (общее снижение индекса ЯОР), либо в сторону увеличения лимфоцитов с 3 ядрышками и более (общее увеличение индекса ЯОР).