Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 4), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

      Бинукелеарные  клетки образуются в норме у человека и животных в печени, сердечной мышце и других тканях (Scherr et al., 1997), высказывается предположение, что эти клетки в дальнейшем полиплоидизируются и могут более эффективно противостоять мутагенному и канцерогенному влиянию условий окружающей среды (Albenus and Koteles, 1996). Наши данные свидетельствуют, что  некоторые вирусы и тяжелые металлы как в условиях in vitro, так и   in vivo способны индуцировать разнообразные цитогенетические нарушения, при этом отмечается, что под влиянием  этих факторов наблюдается возникновение бинуклеарных клеток (Ishisava, 1997).
   Цель настоящей работы - изучить  морфологические и цитогенетические  последствия воздействия на  бинуклеарные лимфоциты человека  вируса Эпштейна-Барр и некоторых солей тяжелых металлов.
  Во всех случаях лимфоциты человека анализировали после 72-часой инкубации в  среде  RPMI-1640 с добавлением ФГА (фирма Difco). Бинуклеары индуцировали при помощи введения на 48 часу в среду инкубации цитоколазина В (Alfred et al., 1989).  Цитоколазин В  препятствует цитокинезу в телофазе митоза, вследствие чего формируются бинуклеарные клетки. Регистрация бинуклеарных лимфоцитов позволяет из общего пула клеток в культуре выделить только те которые разделились в период между 48 и 72 часами инкубации клеток в питательной среде.  Приготовление препаратов проводили методом описанным Колюбаевой с соавт. (1988).    Мазки  культуры клеток окрашивали на ДНК по Фельгену, на РНК по Браше (Хейхоу, Кваглино, 1983), на общие белки   по Yasuma, Itchikawa (1953) и  на белки- гистоны (Alfert,  Geschwind, 1953).  Все анализируемые бинуклеары и мононуклеары фотографировали  при увеличении 100об. х10ок. с помощью цифрового  фотоаппарата фирмы Casio, установленного на микроскоп фирмы Zeiss.  Изображения клеток анализировали на компьютере Panasonic -345  с помощью программы Imajei-0,98 , разработанную в Национальном Институте Здоровья (США). Программа позволяет оценить размеры ядер, количество компактизированного хроматина, аналогичного по степени конденсации  с половым хроматином, а также проводить количественную цитохимию.  Используя этот метод  проведена оценка степени гетероморфизма  ядер в бинуклеарных лимфоцитах по размерам ядер, по степени конденсации хроматина,  содержанию ДНК,  РНК и белков, а также содержанию в бинуклеарных лимфоцитах микроядер.
   Культуры получали от 6 здоровых людей, серонегативных к вирусу Эпштейна-Барр. Половину приготовленных для культивирования образцов предварительно заражали вирусом Эпштейна-Барр путем введения в культуру Т-лимфоцитов суспензионной вируспродуцирующей линии P3HR-1 в количестве 25 тыс. клеток на 1 мл культуры. Вирус был получен в лаборатории онковирусологии НИИ онкологии Томского Научного Центра  СО РАМН.
         Как свидетельствуют полученные данные заражение культуры лимфоцитов здоровых доноров ВЭБ  вызывает достоверное увеличение числа клеток с разнообразными патологиями деления и микроядрами. Среди патологии деления особенно часто отмечались клетки с отставаниями  отдельных хромосом, групп хромосом и фрагментов хромосом в  метафазе и ана-телофазе, мосты в ана-телофазе, трехполюсные  и  особенно неравнополюсные митозы, при этом отмечается асинхронность рекострукции ядер и возникновение их гетероморфизма.  Установлено, что в раковых клетках (лимфома Буркитта) и  клетках культуры зараженной ВЭБ наблюдается снижение площади  конденсированного хроматина. Одновременно происходит возрастание уровня ДНК в бинуклеарных лимфоцитах при их заражении ВЭБ, а также  в клетках лимфомы Буркитта, сопровождаемый резким увеличением гетероморфизма показателей содержания ДНК в ядрах бинуклеарных  лимфоцитов. Особенно велик гетероморфизм в содержании РНК, общих белков и белков - гистонов.
   Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что под влиянием  ВЭБ в условиях культуры клеток наблюдается  увеличение площади лимфоцитов, при этом снижается площадь конденсированного хроматина и одновременно возрастает плоидность клеток. Известно, что ВЭБ стимулирует бласттрансформацию и деление  лимфоцитов крови (Okinava et al.,1995), при этом  происходит деконденсация хроматина, что, по-видимому, приводит к возрастанию функциональной активности ядерного аппарата и  увеличению синтетитческих процессов. Полученные нами данные свидетельствуют, что под влиянием ВЭБ в ядре клетки достоверно увеличивается как уровень РНК, так и белка.
   Известно, что имеется прямопропорциональная зависимость между  содержанием ДНК и белков гистонов в ядре интерфазной и делящейся  клетки (Wied, 1966). В связи с этим патологии митоза приводящие к утрате хромосом или их фрагментов, а также изменение плоидности ведут к изменениям не только к изменению содержания ДНК, но и гистонов. Установлено, что конденсация и деконденсация хроматина тесно связана с гистонами, в связи с этим становиться очевидным, что снижение количества конденсированного хроматина под влиянием ВЭБ сопряжено с уменьшением в клетке содержания гистонов.  Инфицирование клетки ВЭБ стимулирует биосинтез как  нуклеиновых кислот, так и белков (Robertson et al.,1979). Известно, что под влиянием этого вируса  лимфоциты крови способны вступать в стадию синтеза ДНК и превращаться в бласты (Tobishi and Adii, 1987). Поэтому видимое увеличение содержания ДНК в культурах зараженных клеток может быть обусловлено не только изменением плоидности, но также и массовым переходом клеток культуры из стадии G1  в стадию   S.  Метод определения количества гистонов основан на связывании прочного зеленого, при этом считается, что количество окрашенного продукта при рН8 отражает общий положительный заряд окрашиваемого белка (т.е. преобладание основных кислот над кислыми в гистонах), а не общее количество основных аминокислотных остатков в белке. При этом причиной ослабления (или усиления) окраски может служить как действительное уменьшение  количества гистонов, а также маскировкой основных групп гистонов или уменьшением основности гистона, за  счет замены основных аминокислот на кислые, что, в свою очередь,  возможно связать с  возникновением точковых мутаций под влиянием вирусной инфекции (Ilyinskikh et al.,1982). По-видимому, наблюдаемая прямая корреляция между увеличением  числа клеток с микроядрами и снижением количества гистонов в зараженных клетках может свидетельствовать в пользу последнего предположения, т.е. возникновения точковых мутаций, поскольку известна тесная связь между индукцией генных и хромосомных мутаций,  под влиянием самых разнообразных мутагенных факторов (Zapadon et al., 1988).
    Интересным, с нашей точки зрения,  является возникновение феномена гетероморфизма между ядрами в бинуклеарных лимфоцитах. Гетероморфизм площади ядер и их конденсация связаны, по-видимому,  с их функциональной активностью и  изменениями содержания в дочерних ядрах ДНК, РНК и белков. Совершенно очевидно, что  при делении клетки наиболее четко происходит разделение ДНК. И действительно, гетероморфизм по  количеству ДНК в дочерних ядрах бинуклеаров  наблюдается только в условиях зараженных ВЭБ и раковых культурах клеток и коррелирует при этом  с уровнем  клеток с микроядрами  ( r = 0,86; P<0,01) и аномальными митозами (r =0,79; P<0,01).  Механизм  возникновения неравнозначности дочерних ядер по содержанию РНК и белков объяснить гораздо сложнее. В литературе описана ассиметрия дочерних клеток, которая возникает уже при первых делениях зиготы (Folsats et al., 1975). Как правило, это связано с различиями в окружении делящейся клетки, при  этом  та часть делящейся клетки, которая получает питательных веществ больше имеет большие размеры, чем другая, находящаяся в худших условиях. Гипотетически возможно предположить, что во время деления клетка представляет из себя биполь с положительным и отрицательным зарядом (Camerger et al., 1979)  и это вызывает неравнозначную миграцию белков и  РНК.  Не исключено, что эти процессы выражены гораздо интенсивнее  в зараженной, нежели здоровой клетке, кроме того не исключена миграция вирусных частиц и продуктов их метаболизма.  В то же время, гетероморфизм , по-видимому,  возникает уже после деления клетки из-за неравных  функциональных возможностей дочерних ядер. Это может быть связано с асинхронностью митоза (Алов и др., 1968), что часто наблюдается при заражении клетки вирусами (Ilyinskikh et al., 1992), при этом хромосомы достигают полюсов в разное время и реконструкция ядер также происходит асинхронно, что и  приводит, в конечном итоге,  к гетроморфизму дочерних ядер в бинуклеарах. Поскольку гетероморфизм в раковых клетках резко усиливается, то вполне возможно предположить, что это ведет к появлению различных клонов клеток и их селекции, что и обуславливает особую устоичивость опухолей к фармакотерапии.