|
Курило Л.Ф.1,2, Макарова Н.П.1, Шилейко Л.В.1, Королев Ю.Н.3, Никулина Л.А.3, Гениатулина М.С.3, Остроумова Т.В.1
1 - ГУ Медико-генетический научный центр РАМН ( г. Москва)
2 - Кафедра репродуктивной медицины и хирургии ФПДО МГМСУ
3 - РНЦ восстановительной медицины и курортологии МЗ РФ (г.Москва) Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 4), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника В развитии сложной и многообразной реакции организма на действие ионизирующей радиации, кроме непосредственного, прямого, поражающего действия радиации на клетки и ткани, большая роль принадлежит нарушениям нейрогормональной регуляции и аутосенсибилизации. Вследствие этого лучевое поражение представляет собой комплекс взаимосвязанных изменений, затрагивающих, в конечном счете, весь организм [1]. Очень важно предупредить и ограничить развитие таких нарушений, так как они могут прогрессировать и быть основой для дальнейшего развития патологических процессов, могут влиять на жизнь и здоровье не только облученных родителей, но и на потомство [2, 3].
Анализ литературы свидетельствует о том, что частой причиной нарушения сперматогенеза является изменение гормонального режима [4]. В данной работе мы посчитали целесообразным использовать направленное воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения в инфракрасной области спектра (НИЛИ) на надпочечники, которые образуют с гипоталамо-гипофизарной осью единую систему гормональной регуляции сперматогенеза. Мы попытались выяснить возможность использования НИЛИ в качестве профилактики деструктивных изменений, происходящих в дифференцирующихся половых клетках сперматогенного эпителия (СЭ) под воздействием ионизирующего излучения.
НИЛИ было выбрано в связи с его исключительным свойством проникать в глубину ткани. Из клинического опыта известно, что НИЛИ приводит к быстрому стиханию острых воспалительных явлений, стимулирует репаративные (восстановительные) процессы, улучшает микроциркуляцию тканей, нормализует общий иммунитет, повышает резистентность организма, способствует заживлению ран, восстановлению равновесия между компонентами нервной системы [5, 6, 7]. Источником многообразия этих эффектов являются механизмы ответа организма на лазерное облучение.
Цель работы. Методами количественного морфологического анализа сперматогенеза исследовать влияние НИЛИ на состояние репродуктивной системы самцов-крыс и их потомства F1 при общем облучении в средних дозах (2 Гр), а также возможность радиозащитного действия НИЛИ на процессы дифференцировки сперматоцитов I и II порядка.
Материалы и методы. Эксперимент был проведен на половозрелых нелинейных крысах-самцах массой 250-280 г. Животные – родители (15 особей) были поделены на несколько групп. Группу из пяти крыс подвергали в течение десяти процедур воздействию НИЛИ в импульсном режиме в область надпочечников с помощью прибора «Лазерный ПЛ- 1» ALFA-1M. Процедуру облучения крыс НИЛИ проводили при частоте 400 Гц. В контрольной группе животных не подвергали лазерному воздействию, а имитировали его, прикладывая в область надпочечников пластину-плацебо. Затем животных-родителей F0 опытной и контрольной групп подвергали однократному общему облучению на установке ГУБЕ (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН) гамма-лучами 60Со дозой 2 Гр (мощность дозы 0,57 Гр/мин). Кроме того, в эксперименте присутствовали интактные крысы (Таблица 1). Забой животных проводили на 62 день после облучения. Также в работе были исследованы 11 крыс – потомство F1 интактных самок и облученных крыс-самцов, которые были разбиты на 3 группы: интактные животные, потомство опытной и потомство контрольной групп. Потомство всех групп поколения F1 никаким воздействиям, в том числе радиационным, не подвергали. По достижении 4,5 месячного возраста крыс-самцов потомства F1 декапитировали и производили забор материала. Обработку отпрепарированных семенников проводили по общепринятой методике с модификациями [8]. Состояние сперматогенеза оценивали следующим образом. Подсчитывали 100 извитых семенных канальцев (ИСК), срезанных строго поперечно, отмечая среди них ИСК, содержащие 4 генерации половых клеток (сперматогонии, сперматоциты 1-го и 2-го порядка, сперматиды и сперматозоиды), ИСК с 3 генерациями (те же клетки, но без сперматозоидов), ИСК с 2 генерациями (сперматогонии и сперматоциты 1-го и 2-ого порядка), ИСК с 1 генерацией (сперматогонии), 0 генераций в присутствии только клеток Сертоли и ИСК в состоянии запустевания. Определяли долю каждого из описанных типов ИСК (в процентах от 100 ИСК), а также рассчитывали индекс сперматогенеза [8]. Одновременно отмечали число ИСК с явлениями слущивания незрелых половых клеток (НПК) в просвет ИСК, состояние собственной оболочки ИСК, пустоты и расслоения СЭ в расчете на 100 канальцев.
Процесс дифференцировки сперматоцитов первого и второго порядка оценивали на основании подсчета метафазного индекса [9 в модификации]. Метафазный индекс сперматоцитов I и II – МИ – определяли как отношение количества делящихся спермaтоцитов I и II на XIV стадии цикла СЭ к числу клеток Сертоли, встречающихся на этой же стадии (на 50 срезов). Для определения степени достоверности полученных результатов использовали t-критерий Стьюдента с проверкой классических условий применимости [10]. Результаты считали достоверными, если уровень значимости не превышал 0,05 (p<0,05). Всю статистическую обработку производили в системе STATISTICA 6.0.
Результаты и обсуждение. Результаты первой части эксперимента по изучению состояния СЭ облученных самцов представлены в Таблице 1. При морфометрическом анализе выявлено снижение числа ИСК с 4 генерациями половых клеток в контрольной группе по сравнению с таковым показателем крыс интактной группы (40,0+- 0,4% – интактная группа; 13,8+-1,0% – контрольная группа) и повышение числа ИСК с 3 генерациями половых клеток (60,0+-0,4% – интактная группа; 86,2+-1,0% – контрольная группа), что может указывать на снижение активности сперматогенеза у животных контрольной группы под воздействием ионизирующего излучения. Меньшее число половых клеток доходило до конечных стадий дифференцировки и гибло на более ранних этапах гаметогенеза. Это нарушение приводило к достоверному снижению индекса сперматогенеза у крыс контрольной группы (3,40+-0,04 – интактная группа; 3,11+-0,01 – контрольная группа; р<0,01).
Таблица 1. Состояние сперматогенного эпителия семенников облученных крыс поколения F0 | Группа экспериментальных животных | Число животных в группе | МИ, усл.ед. | Генерации половых клеток СЭ, % | Индекс сперматогенеза, усл.ед. | Слущивание НПК в просвет ИСК, % | Пустоты и расслоения СЭ, % | Атипия собственной оболочки ИСК, % | | 4 генерации | 3 генерации | 2 генерации | 1 генерация | | Интактная | 5 | 2,41±0,1 | 40,0± 0,4 | 60,0±0,4 | 0 | 0 | 3,40±0,04 | 0,25±0,2 | 0,5±0,2 | 1,0±0,01 | | Контроль НИЛИ (лазерное плацебо+ облучение) | 5 | 1,42±0,1* | 13,8±1,0** | 86,2±1,0 | 0 | 0 | 3,11±0,01* | 11,4±3,0*** | 16,4±1,2 | 14,0±1,0 | | Опыт НИЛИ (НИЛИ+ облучение) | 5 | 2,05±0,2**** | 20,2±0,3** | 79,8±0,3 | 0 | 0 | 3,20±0,01 | 3,4±0,7*** | 3,0±0,7 | 1,8±0,2 | * p<0,01 по сравнению с интактной группой **p<0,01 по сравнению с контрольной группой ***p<0,05 по сравнению с контрольной группой **** p<0,05 по сравнению с интактной группой
У животных контрольной группы также были обнаружены расслоения СЭ: вакуолеподобные межклеточные пространства в СЭ вследствие активного слущивания НПК в просвет ИСК. Количество ИСК, в которых была обнаружена десквамация НПК, составило 11,4+-3,0%, что превысило аналогичный показатель у крыс интактной группы (0,25±0,2%). В собственной оболочке ИСК была отмечена некоторая складчатость и «фестончатость». Количество сперматоцитов I и II в СЭ на XIV стадии ЦСЭ животных контрольной группы отчетливо снижалась, об этом свидетельствует достоверное уменьшение МИ на 35,1% по сравнению с интактными животными (2,41+-0,1 – интактная группа; 1,42+-0,1 – контрольная группа; р<0,01).
Результаты морфологического анализа СЭ животных опытной группы показывают, что применение НИЛИ до процедуры облучения крыс дало положительный эффект на СЭ облученных родителей: количество ИСК с 4 генерациями половых клеток достоверно увеличено по сравнению с этими показателями в контрольной группе (20,2±0,3% - в опытной группе, р<0,01). Количество НПК, слущенных в просвет ИСК, достоверно сократилось по сравнению с контрольной группой, но все-таки не достигло уровня интактной группы, что говорит о негативном влиянии облучения в дозе 2 Гр (3,4+-0,7 – в опытной группе; p<0,05). МИ у крыс опытной группы был выше такового показателя у крыс контрольной группы и составил 2,05+-0,2, однако, не достиг показателей крыс интактной группы (p<0,05).
Таблица 2. Состояние сперматогенного эпителия семенников потомства облученных родителей (F1) | Группа экспериментальных животных | Число животных в группе | МИ, усл.ед. | Генерации половых клеток в СЭ, % | Индекс сперматогенеза, усл.ед. | Слущивание НПК в просвет ИСК, % | Пустоты и расслоения СЭ, % | Атипия собственной оболочки ИСК, % | | 4 генерации | 3 генерации | 2 генерации | 1 генерация | | Интактная F1 | 4 | 2,36±0,1 | 36,0±3,3 | 61,75±2,1 | 0 | 0 | 3,29±0,1 | 0,66±0,3 | 0 | 0 | | Контроль НИЛИ F1 | 3 | 0,71±0,03* | 19,0±3,6* | 81,0±3,6** | 2,33±0,8* | 0 | 3,19±0,01 | 2,0±0,5 | 3,33±0,3 | 3,33±0,3 | | Опыт НИЛИ F1 | 4 | 0,95±0,1* | 30,0±3,1 | 70,0±3,1* | 0 | 0 | 3,29±0,01*** | 1,2±0,4 | 1,66±0,3 | 2,33±0,8 | *p<0,05 по сравнению с интактной группой **p<0,01 по сравнению с интактной группой *** p<0,01 по сравнению с контрольной группой
Результаты второй части эксперимента, связанной с изучением СЭ потомства F1 облученных родителей-самцов, представлены в Таблице 2. Из нее следует, что у 4,5-месячного потомства F1 контрольной группы по сравнению с потомством интактных крыс в семенниках уменьшено число ИСК с 4 генерациями клеток (36,0+-3,3 – в интактной группе; 19,03,6 – в контрольной группе; р<0,05), а число ИСК с 3 генерациями, наоборот, возрастало (61,75+-2,1 – в интактной группе; 81,0+-3,6 – в контрольной группе; р<0,01, табл.2). При этом обнаружены единичные ИСК, в которых присутствовало две генерации половых клеток (сперматогонии и сперматоциты). Количество таких ИСК составило в контрольной группе 2,33+-0,8. Индекс сперматогенеза в контрольной группе крыс поколения F1 оставался на более низком уровне по сравнению с таковым у крыс поколения F1 интактной группы (3,29+-0,1 – у крыс интактной группы; 3,19+-0,01 - у крыс контрольной группы). В контрольной группе МИ достоверно снижен по сравнению с таковым показателем у крыс интактной группы (2,36+-0,1 – интактная группа; 0,71+-0,03 – контрольная группа). Также у крыс контрольной группы, несмотря на то, что никаким воздействиям животных не подвергали, значительно увеличено количество НПК, слущенных в просвет ИСК (0,66+-0,3 – интактная группа; 2,0+-0,5 – контрольная группа). Среди НПК, найденных в просвете ИСК животных поколения F1 контрольной группы, часто встречались и сперматоциты первого и второго порядка.
У животных опытной группы поколения F1 при морфологическом анализе СЭ наблюдали достоверное увеличение индекса сперматогенеза (р<0,01), который по своему значению достиг такового интактной группы (3,29+-0,01). Остальные показатели состояния сперматогенеза (количество генераций СЭ, слущивание НПК, состояние собственной оболочки ИСК) также стремились к показателям у животных интактной группы. Однако МИ первичных и вторичных сперматоцитов у крыс поколения F1 опытной группы оставался достоверно низким по сравнению со значением МИ крыс интактной группы (0,95+-0,1 – в опытной группе, p<0,05). Это может служить показателем нарушений дифференцировки половых клеток в составе СЭ у потомства F1 облученных родителей.
На основании количественного морфологического анализа СЭ облученных крыс поколения F0 и их потомства F1 можно говорить о том, что ионизирующее облучение в средних дозах (2 Гр в нашем случае) вызывает негативные изменения в клетках СЭ не только облученных животных, но и распространяется на их потомство. Действие радиации в указанных дозах оказывает существенные сдвиги в морфологическом состоянии семенников крыс, что проявляется, в частности, в развитии дистрофических и дегенеративных процессов в СЭ, усилении слущивания незрелых половых клеток, угнетении сперматогенеза, снижению количества первичных и вторичных сперматоцитов на XIV стадии ЦСЭ.
Результаты эксперимента показывают, что применение НИЛИ перед облучением самцам-родителям оказывает влияние на некоторые показатели состояния семенников их потомства. Применение низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения в импульсном режиме до общего радиационного облучения оказывает защитное действие, выражающееся, в основном, в уменьшении проницаемости структур собственной оболочки ИСК, снижении уровня деструктивных процессов в СЭ и клетках Сертоли, усилении внутриклеточных адаптивных реакций, защите первичных и вторичных сперматоцитов. Суммарная реализация этого защитного эффекта, по-видимому, осуществляется через общие нейро-эндокринные механизмы и систему гомеостаза. Под воздействием НИЛИ в область надпочечников происходит изменение уровня гормонов в крови, что может являться одной из причин изменения протекания процесса сперматогенеза и функционирования ГТБ.
На основании полученных результатов, предполагаем, что НИЛИ улучшает трофику тканей ИСК, обеспечивая увеличение жизнеспособности сперматогенных клеток облученных родителей-самцов и их интактного потомства поколения F1. Литература
1. Роль надпочечников в биохимических сдвигах при действии малых доз ионизирующей радиации. Ред. проф. Л.С. Черкасова, Минск: Наука и техника, 1969, 185 с.
2. Воробцова И.Е. Влияние облучения родителей на физиологическую полноценность и риск канцерогенеза у потомства первого поколения организмов разных видов. Автореф. дисс. … д-ра. биол. наук, Л: 1988, 43 с.
3. Нефедов И.Ю., Наследственные последствия облучения обоих родителей (экспериментальное исследование на крысах линии Вистар), Автореф дисс. … д-ра биол.наук, Обнинск: 1998, 48 с.
4. Кация Г.В., Гончаров Н.П. Взаимодействие систем гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников и гипоталамус-гипофиз-гонады // Вестн. АМН СССР.- 1994. №12.-с.44-47.
5. Королев Ю.Н., Панова Л.Н., Гениатулина М.С. Коррекция субклеточных пострадиационных изменений в гипоталамусе и паращитовидной железе при использовании низкоинтенсивного лазерного излучения (экспериментальное исследование) // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры.-2000. №6.-с.3-4.
6. Королев Ю.Н., Макарова Н.П., Курило Л.Ф. и др. Адаптационные изменения интерстициальной ткани семенников крыс при профилактическом действии лазерного излучения с последующим радиационным облучением, Томск, конф. "Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения, 20-21 апреля 2005г., с.98-99.
7. Макарова Н.П., Королев Ю.Н., Курило Л.Ф. и др. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения на ткань семенника при общем радиационном облучении, Андрология и генитальная хирургия, 2005, №1, с.23-25.
8. Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф. Морфометрические методы в оценке функционального состояния семенников // Архив анат., гистол. и эмбриол., 1983, т.84, N3, с.66-72.
9. Мамина В.П. О механизмах действия малых доз ионизирующей радиации на сперматогенный эпителий // Пробл. репродукции.-2003. №2.-с.22-24.
10. Орлов А.И. О применении статистических методов в медико-биологических исследованиях // Вестн. АМН СССР.- 1987. №2.-с.88-94.
11. Чудновский В.М., Леонова Г.Н., Скопинов С.А. и др., Биологические модели и физические механизмы лазерной терапии, Владивосток: Дальнаука, 2002, 155 с.
12. Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции. М: Наука, 1985, 206 с.
13. Real A., Sundell-Bergman S., Knowles J. F. et. al. Effects of ionising radiation exposure on plants, fish and mammals: relevant data for environmental radiation protection // J. Radiol. Prot.-2004.-24.-P.123-137
|
