Туберкулёз вызывается внутриклеточным патогеном Mycobacterium tuberculosis и ответственен за 8 млн. новых случаев заболевания туберкулёзом ежегодно, из которых 3 млн. заканчиваются летальным исходом. BCG - является широко применяемой противотуберкулёзной вакциной. Но в основном она индуцирует высокий уровень защиты против туберкулёза на животной модели инфекции. Однако, для человека её эффективность является труднопрогнозируемым фактором, который может изменяться от 0 до 80%. Вакцинация BCG не обеспечила контроля над туберкулёзной инфекцией, что указывает на необходимость создания новых, более действенных вакцин. Наша стратегия направлена на один из наиболее перспективных подходов- ДНК-вакцину в качестве компонента вирусоподобных частиц (ВПЧ). ДНК вакцина способна индуцировать как гуморальный, так и Т-клеточный иммунные ответы. Методология создания таких частиц была разработана в ГНЦ ВБ «Вектор» и апробирована на примере кандидатной вакцины против ВИЧ инфекции. Эти частицы представляют собой полинуклеотидный комплекс (двуспиральная РНК или плазмидная ДНК, кодирующая антигены), окруженный полисахаридной матрицей, состоящей из молекул полиглюкина.
Целью данной работы явилась оценка перспективности использования ВПЧ в качестве системы доставки ДНК-вакцин против туберкулёза на животной модели.
В качестве объекта исследования был выбран антиген ESAT-6, который является доминантной мишенью для Т-клеточного иммунитета на ранней стадии инфекции у пациентов так же, как и на различных животных моделях.
Для получения рекомбинантного белка ESAT6 его ген был клонирован в плазмиду pGEX-2T("Invitrogen", США). Структура полученной конструкции была подтверждена рестрикционным анализом. Гибридный белок GST-ESAT6 был наработан культуре клеток E.coli и выделен с помощью аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе 4В. Продукцию белка GST- ESAT-6 оценивали с помощью SDS-электрофореза и иммуноблоттинга. Молекулярная масса гибридного полипептида составила около 40 кДа, что соответствует ожидаемой. Для создания ДНК-вакцины ген ESAT6 был клонирован под контроль эукариотического промотора в плазмиду pcDNA3.1mychislacZ(-) ("Invitrogen", США). Структура полученной конструкции была подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием методом Сен-гера.
Далее была   создана  экспериментальная   конструкция на основе микрочастиц, содержащих рекомбинантную ДНК pcDNA3.1mychislacZ(-)/ESAT6. Для сборки искусственной микобактериальной частицы в качестве "центрального ядра" использовали плазмидную ДНК pcDNA3.1mychislacZ(-)/ESAT6, которую инкубировали с активированным коньюга-том, и образовавшийся комплекс отделяли гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B. Сборку частиц контролировали с помощью электрофореза по разнице подвижности нук-леотидного материала в нативной форме и в составе частиц, а так же по устойчивости нуклеотидного материала к обработке ДНКазой. Опыт показал, что если для исходной плазмидной ДНК полная деградация наблюдалась уже через 1 час инкубации, то в собранной конструкции нуклеотидный материал сохранялся интактным в течение 9 часов.

При электронном микроскопировании частицы имели в основном шарообразный вид,10-20нм в диаметре (рис.) После троекратной иммунизации такой конструкцией (по 10 мкг на инъекцию) у мышей на 7 и 21 сутки после начала опыта индекс стимуляции спленоцитов был достоверно выше такового для неиммунизированных мышей, что подтверждает иммуногенность экспериментального препарата.
Таким образом, получен экспериментальный препарат в виде вирусоподобных частиц, содержащий микобактериальный Т-клеточный антиген ESAT6. В дальнейшем планируется изучение его иммуногенных и протективных свойств и сравнение с защитным эффектом, создаваемым вакциной BCG на мышиной модели туберкулёза.