Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Кафедра фундаментальных основ клинической медицины

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 68-й научной итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 20-22 апреля, 2009 год); под реакцией академика РАМН В.В. Новицкого, член. корр. РАМН Л.М. Огородовой

Посмотреть титульный лист сборника

Скачать сборник целиком (1,5 мб)

 

TNFα способен запускать одновременно несколько путей программированной клеточной гибели, приводящих к активации каскада каспаз, а также к накоплению АФК в клетке. Эти процессы обуславливают нарушение целостности мембраны митохондрий и, как следствие, выброс из них апоптогенных факторов [4]. Выход митохондриальных факторов находится под непосредственным контролем белков семейства Bcl-2, включающего индукторы и ингибиторы апоптоза, от соотношения которых зависит реализация клеточной гибели. Для полного понимая процессов регуляции, происходящих в клетке, получившей смертельный сигнал, необходимо тщательное изучение влияния TNFα на митохондриальный путь апоптоза, что должно в перспективе способствовать более глубокому пониманию индивидуальных особенностей патогенеза заболеваний, связанных с изменением продукции данного цитокина.
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение молекулярных механизмов реализации TNFα-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови в условиях in vitro.
Материалы и методы: в рамках проведенного экспериментального исследования были использованы лимфоциты, полученные у 12 (7 женщин и 5 мужчин в возрасте от 22 до 30 лет) здоровых доноров, не страдавших инфекционными заболеваниями и не предъявлявших на момент обследования жалоб соматического профиля. Выделенные путем градиентного центрифугирования, лимфоциты культивировали в полной питательной среде (RPMI-1640 («Вектор», Россия); инактивированная эмбриональная телячья сыворотка («Sigma-Aldrich», США); L-глутамин («Вектор», Россия)) и в этой же среде, но с добавлением рекомбинантного TNFα (rTNFα) («Biosource», США) в конечной концентрации 0,05 нг/мл. С помощью метода проточной лазерной цитометрии определяли число апоптотически измененных лимфоцитов крови в аннексиновом тесте («Beckman Coulter», Франция), количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий с применением флюоресцентного красителя JC-1 («BD Pharmigen, США») и внутриклеточное содержание активных форм кислорода с использованием ДХФ-ДА (дихлорфлюоресцеина диацетата) («Sigma-Aldrich», США). Методом вестерн-блоттинга с использованием первичных антител («Sigma-Aldrich», США) определяли содержание белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad) в лимфоцитах. Полученные данные проверяли на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова, достоверность различия показателей оценивали с применением критерия Манна-Уитни. Результаты представлены в виде медианы и квартилей (Mе (Q1-Q3)) в таблице 1.
Результаты: в культуре с добавлением rTNFα по сравнению с интактными лимфоцитами было зарегистрировано увеличение количества клеток, находящихся в апоптозе, и возрастание числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий что подтверждает апоптогенное действие TNFα на культуру клеток [1]. Кроме того, наблюдалось повышение содержания АФК в лимфоцитах (табл.1), свидетельствующее о способности TNFα измененять редокс-состояния клеток, что приводит к активации транскрипционного фактора NF-κB, регулирующего индуцибельную экспрессию ряда генов, участвующих в выживании и удалении клеток с помощью механизмов апоптоза, в том числе генов, кодирующих белки семейства Bcl-2. Помимо этого, TNFα способен запускать митохондриальный путь клеточной гибели через активацию белка Bid [3].
При анализе содержания белков семейства Bcl-2 в клетках, культивированных с rTNFα, было обнаружено снижение данного показателя для Bcl-2, Bcl-XL и Bax, а также увеличение количества Bad (табл. 1). Уменьшение количества антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-XL и повышение уровня проапоптотического Bad свидетельствует о смещении соотношения белков семейства Bcl-2 в сторону преобладания индукторов апоптоза. Снижение уровня белка, Bax, вероятно, обусловлено его связыванием с Bcl-2, и встраиванием образовавшегося комплекса в мембраны митохондрий с образованием пор [2].
Таким образом, при действии на лимфоциты крови рекомбинантной формы TNFα, наблюдается повышение уровня апоптоза изучаемых клеток, сопровождающееся вовлечением митохондриального пути, обусловленного дисбалансом содержания белков семейства Bcl-2, регулирующих программированную клеточную гибель.

Таблица

Показатели апоптоза лимфоцитов крови в условиях культивирования in vitro с рекомбинантной формой TNFα в дозе 0,05 нг/мл Mе (Q₁-Q₃)

Показатели	Интактная культура лимфоцитов	Культура лимфоцитов, культивированных с рекомбинантным TNFα
Количество лимфоцитов в апоптозе, %	1,69 (1,05-2,07) p<0,001	8,73 (8,02-10,57) p<0,001
Количество лимфоцитов со сниженным Δψm, %	2,24 (1,37-2,77) p<0,001	4,54 (2,48-6,36) p<0,001
Внутриклеточное содержание активных форм кислорода, усл. ед	0,035 (0,008-0,093) p<0,001	0,079 (0,076-0,326) p<0,001
Внутриклеточное содержание Bcl-2, усл. ед.	1,30 (1,22-1,45) p<0,05	0,70 (0,58-0,89) p<0,05
Внутриклеточное содержание Bcl XL, усл. ед	1,90 (1,59-1,98) p<0,05	1,13 (0,79-1,28) p<0,05
Внутриклеточное содержание Bax, усл. ед	0,97 (0,89-1,04) p<0,05	0,35 (0,33-0,37) p<0,05
Внутриклеточное содержание Bad, усл. ед	0,56 (0,52-0,58) p<0,05	0,83 (0,70-0,96) p<0,05

Примечание: p – достоверность различий по сравнению с аналогичными показателем интактных клеток,

Δψ_m – трансмембранный потенциал митохондрий.

Список литературы:
1.    Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели / М. Бра, Б. Квинан, С. Сузин // Биохимия. – 2005. – Т. 70, вып. 2. – С. 284-293.
2.    Молекулярные основы патологии апоптоза / Н. Н. Белушкина, С.Е. Северин // Архив патологии. – 2001. – № 1. – С. 51-60.
3.    Дизрегуляционная патология / Под ред. Г. Н. Крыжановский. – М.: Медицина, 2002. – 632 с.
4.     Потапнев, М. П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М. П. Потапнев // Иммунология. – 2002. – Т.23, № 4. – С. 237-243.