Шуйский государственный педагогический университет, г.Шуя, Областной онкологический диспансер, г. Владимир;  Всероссийский НИИ защиты растений, г.Санкт-Петербург

    Механизмы внутриклеточного транспорта активно изучаются ведущими лабораториями мира в области молекулярной и клеточной биологии т. к. их понимание позволит начать целенаправленный поиск лекарственных препаратов для лечения заболеваний, в основе которых лежат нарушения транспорта белков через комплекс Гольджи (КГ). Однако существующие в настоящее время модели «везикулярная», предложенная Дж. Паладе почти 30 лет назад, и модель «созревания и прогрессии цистерн» не объясняют всех имеющихся в литературе экспериментальных данных, в частности отсутствие в 50-60 нм везикулах, которым отводиться в обеих моделях основная транспортная роль, как многих известных транспортируемых белков (альбумина, проинсулина), так и ферментов комплекса Гольджи. В последние время начинает обсуждаться возможная роль непрерывных тубулярных соединений в внутриклеточном транспорте (Clermont Y. et all., 1994, Mironov A.A. et. all., 2005). В нашем исследовании, на основе анализа ультраструктурных особенностей секреторных путей микроспоридий (Microsporidia), мы сделали попытку показать центральную роль тубулярных соединений в транспорте белков через комплекс Гольджи.
Микроспоридии (Nosema grylli), облигатные внутриклеточные паразиты, были выбраны нами, как один из самых маленьких эукариотических организмов, размером 2-3 µm в диаметре (в зависимости от вида) с геномом 2 Mb, и как наиболее простая клеточная модель. В своем жизненном цикле микроспоридии проходят несколько хорошо различимых электронно-микроскопически стадий развития: спороплазма, меронт, споронт и зрелая спора.
Спороплазма, небольшой двуядерный зародыш, который проникает с помощью полярной трубки в организм хозяина, где начинает размножаться. На стадии меронта паразит синтезирует ряд белков, в частности белок полярной трубки (PTP) и р40 – белок cпоровой стенки, которые синтезируются на мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР) и транспортируются до уровня тубулярных кластеров, представляющих собой первичный комплекс Гольджи. В клетках этой стадии отсутствует белковое покрытие на внешней поверхности плазматической мембраны, часть рибосом рассеяно по цитоплазме, часть находиться на мембранах эндоплазматического ретикулума. Типичной диктиосомальной структуры комплекса Гольджи в клетках не обнаруживается.
На ультратонких эпоновых срезах ранних мерогональных клеток мы находим группы скоплений трубчато-варикозных мембранных профилей, размерами около 300 нм. Обычно в клетке регистрируется 5-6 таких скоплений, рассеянных по цитоплазме и не связанных между собой. Часть мембранных трубочек имеет расширенные округлые профили, другая - более гладкие и удлиненные. Диаметр трубочек в суженной части 25-30 nm, диаметр варикозных расширений 45-50 nm. Свободных округлых мембранных профилей не регистрируется. Все изученные группы трубчатых структур имеют тубулярные связи с ЭР и ядерной мембраной.
Электронная микроскопическая томография с последующей реконструкцией трехмерного изображения показала в каждой группе скоплений мембранных трубочек два компонента: извитые, варикозные трубочки, которые выглядят как скопление округлых структур, соединенных между собой мембранными трубочками, и скопление трубочек с более сглаженными стенками. Оба типа мембранных структур переходят один в другой и тесно ассоциированы друг с другом. На варикозных трубочках иногда регистрируются окаймленные почки, в то время как на гладких таковые нами обнаружены не были. Не обнаружено на томограммах и свободных везикул. Варикозные тубулярные сплетения тесно ассоциированы с цистернами ЭР, которые, как правило, расположены вокруг тубулярных сетей и имеют с ними мембранные соединения.
    На третьей стадии развития, в споронте, начинается формирование споры. Увеличивается синтез белка, необходимого для формирования споровой стенки и полярной трубки. На этой стадии, на поверхности плазматической мембраны начинает скапливаться электронно-плотный материал, увеличивается количество цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума, которые упаковываются в стопки. Сеть тубулярных скоплений увеличивается в размерах и может достигать до 900 нм. Электронная томография показывает, что структура трубочек не меняется, однако за чет увеличения объема трубочки становятся более изогнутыми. Свободных везикул так же не обнаруживается. В позднем споронте начинает формироваться полярная трубка, органелла, при помощи которой паразит попадает в организм хозяина. В это время все тубулярные скопления собираются у одного полюса клетки. На эпоновых срезах тубулярная сеть часто выглядит как скопление группы везикул. Однако электронная томография с последующей трехмерной реконструкцией показала, что все округлые расширенные структуры соединены между собой тонкими мембранными трубочками. На этой стадии могут возникать перфорированные цистерно-подобные мембранные структуры.
Таким образом, варикозные сети существуют на всех стадиях развития паразита, при этом к последней стадии увеличиваются в размерах и становятся более выраженными. Изолированные округлые мембранные профили не обнаруживаются ни в одной из стадий жизненного цикла паразита.
Для доказательства отсутствия в клетке свободных везикул мы проанализированы ультраструктурные изменения комплекса Гольджи, индуцированные путем блокирования слияния везикул с помощью фторида алюминия (AlF4) и NEM (вещество, которое блокирует белки, ответственные за слияние мембран) в клетках микроспоридий. Известно, что в зависимости от наличия и активности COPI белкового комплекса, прикрепляющегося к цитоплазматической стороне мембраны и способствующего образованию везикул, при блокировании механизмов их слияния, возникает трансформация КГ, связанная с накоплением везикул (везикуляция КГ). Известно так же, что микроспоридии имеют минимальный набор белков СОРI и СОРII белков, при этом отсутствует клатрин (Katinka et al., 2001). Поэтому теоретическая вероятность формирования свободных везикул существует. Однако ни один из использованных нами механизмов блокирования слияния мембран не привел к изменению ультраструктуры КГ микроспоридии. Эти результаты доказывают, что имеющийся у микроспоридии набор субьединиц COPI – покрытия не способен образовывать плотные беловые покрытия, необходимые для формирования везикул. Таким образом, в клетках микроспоридии транспорт осуществляется без посредничества COPI-везикул, что делает неприемлемой везикулярную теорию транспорта для данной клеточной системы.
    Морфо-функциональный анализ секреторного пути в клетках микроспоридии Nosema grylli показал отсутствие диктиосомальной структуры комплекса Гольджи и свободных 50-60 нм везикул, что свидетельствует о недостаточной обоснованности общепринятых моделей секреторного транспорта («везикулярной» и «созревания и прогрессии цистерн»). При этом единственной функциональной мембранной структурой комплекса Гольджи микроспоридии являются гладкие и варикозные трубочки, образующие сплетения, имеющие мембранные соединения, как с плазматической мембраной, так и с эндоплазматическим ретикулумом. На основании имеющихся литературных данных о наличие в сетях такого типа микроспоридий ферментов КГ, мы идентифицировали описанные мембранные структуры как тубулярно-варикозную фрагментированную морфологическую форму комплекса Гольджи. Кроме того, существование секреторного транспорта, при невозможности формирования везикулярных переносчиков, указывает на осуществление транспортной функции в клетках микроспоридий тубулярными структурами, которые сохранились в качестве основной функциональной структуры и у высших эукариот, на основе которой сформировалась эффективная, динамичная мембранная система комплекса Гольджи, осуществляющая сортировку и селективный транспорт белка.

Литература
1.    Clermont Y., Rambourg A., Hermo L. Connections between the various elements of the cis- and mid-compartments of the Golgi apparatus of early rat spermatids. Anat. Rec., 1994, v. 240, p. 469-480.
2.    Palade G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science, 1975, v. 189, p. 347-358.
3.    Katinka M.D. Genome seguense and gene compaction of the eukaryote parasite Encephalitozoon cuniculi. Nature, 2001, v. 414, p. 450-453.
4.    Mironov, A. A., Beznoussenko, G. V., Polishchuk, R. S. and Trucco, A.  Intra- Golgi transport: a way to a new paradigm? Biochim. Biophys., 2005, Acta 1744, 340-350.