Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, лаборатория популяционной генетики
Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 66-й научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 2007 год) под редакцией проф. Новицкого В.В. и д.м.н. Огородовой Л.М.
Скачать сборник целиком (формат .PDF, 1,5 мб)
Гипертрофическая кардиомиопатия – распространенное наследственное заболевание миокарда с аутосомно-доминантным типом наследования. Фенотипически характеризуется гипертрофией миокарда, чаще асимметричного характера с преимущественным поражением левого желудочка и межжелудочковой перегородки. Большинство мутаций, вызывающих гипертрофическую кардиомиопатию, локализовано в генах, кодирующих белки сократительного аппарата клетки [4]. В настоящее время известно около 400 мутаций, ассоциированных с гипертрофической кардиомиопатией [5]. Для этого заболевания характерна неполная экспрессивность и пенетрантность мутаций, увеличивающаяся с возрастом. Диапазон клинических проявлений мутаций очень широк – от бессимптомного течения до тяжелых форм. Иногда первым проявлением заболевания может стать внезапная смерть. Гипертрофическая кардиомиопатия является одной из основных причин кардиогенной внезапной смерти в молодом возрасте [4]. Распространенность заболевания, по некоторым оценкам, составляет 0,2 % (1:500) [3]. Значительная часть мутаций локализована в гене тяжелой цепи ?-миозина (MYH7). ?-миозин – основной белок, входящий в состав толстых филаментов кардиомиоцитов и принимающий непосредственное участие в сокращении миокарда [4]. Данные об отдельных мутациях, являющихся причиной заболевания, могут использоваться в ДНК-диагностике и иметь важное прогностическое значение.
Цель исследования заключалась в поиске мутаций методом анализа однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP-анализа) в кодирующей последовательности гена тяжелой цепи ?-миозина у больных с диагнозом гипертрофическая кардиомиопатия.
В исследование было включено 17 человек с диагнозом гипертрофическая кардиомиопатия. В качестве контрольной группы использовалась выборка из 115 человек, не имевших признаков заболеваний сердечно-сосудистой системы на момент обследования. Пациенты были обследованы в НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН. Диагноз ставился на основании результатов клинико-инструментального обследования в соответствии с критериями ВОЗ. Основным методом диагностики являлось эхокардиографическое исследование. До проведения обследования больные не принимали кардиотропных препаратов.
Материалом для исследования являлась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции.
Поиск мутаций проводили в экзонах 4–40 гена тяжелой цепи ?-миозина. Фрагменты ДНК, содержащие исследуемые экзоны, были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Условия ПЦР для каждого экзона подбирались при градиенте температуры отжига праймеров от 52 до 61°С с использованием разных буферов с различной концентрацией ионов Mg2+. Результаты амплификации оценивали при помощи электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, и визуализации в ультрафиолетовом свете. Поиск мутаций осуществляли методом SSCP-анализа. ПЦР-продукты денатурировали, после чего подвергали электрофоретическому разделению в градиентном неденатурирующем полиакриламидном геле. Электрофорез проводили при двух температурных режимах: 12°С и 24°С. Для визуализации результатов применяли окраску геля серебром. Фрагменты ДНК с измененной электрофоретической подвижностью подвергали секвенированию по методу Сэнгера на автоматическом ДНК-анализаторе. В случае идентификации предполагаемой мутации проводили исследование контрольной выборки методом рестрикционного анализа ПЦР-продуктов. Для генотипирования замены Ala729Pro использовали рестриктазу HaeIII.
В результате исследования у одного пробанда была идентифицирована миссенс-мутация в 20 экзоне гена тяжелой цепи ?-миозина в гетерозиготном состоянии, ведущая к замене аланина на пролин (Ala729Pro). Найденная мутация представляет собой трансверсию – замену гуанина на цитозин. Эта замена не была выявлена в контрольной выборке из этой же популяции, следовательно, она является мутацией, а не полиморфизмом. Замена аланина на пролин не приводит к изменению заряда в полипептидной цепи, т. к. обе аминокислоты являются неполярными. Мутация локализована в конвертере – участке миозина, играющем важную роль в конформационных изменениях молекулы миозина во время сократительного цикла. Дефект белка может приводить к нарушению структуры миофибрилл и сократительной способности миокарда [4]. Мутация найдена у пациента 23 лет с тяжелой формой гипертрофической кардиомиопатии ассиметричного характера с признаками обструкции выходного тракта левого желудочка. Толщина межжелудочковой перегородки 33 мм (норма до 15 мм), индекс массы миокарда левого желудочка 205,6 г/м2 (норма до 134 г/м2). Родственники пациента обследованы не были.
Мутация Ala729Pro была описана в 2005 г. Она была найдена у двух неродственных пациенток из российской популяции, у которых отмечалось раннее начало заболевания и высокая степень гипертрофии [2]. В исследованиях, проведенных в других странах, данная мутация не была описана. Это может свидетельствовать о том, что мутация Ala729Pro распространена в российской популяции.
Мутация была найдена у пациента с тяжелой формой кардиомиопатии, тогда как большая часть выборки была представлена пациентами с умеренной степенью гипертрофии миокарда и более поздним началом заболевания. На основании результатов данного исследования и данных литературы [1, 2, 4], можно предположить, что мутации в гене тяжелой цепи ?-миозина в большинстве случаев приводят к развитию тяжелой формы ГКМП.
