Калужский государственный педагогический университет им. К.Э. Циолковского

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Исследовали частоту мейотического кроссинговера и силу генетической интерференции у самок Drosophila melanogaster, подвергнутых воздействию низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения (l=890 нм) в различные фазы лунной активности. Показано, что лазерное излучение в дозе 0,0088 Дж/см2 вызывает изменения изучаемых показателей только при воздействии в определённые фазы лунного цикла. При этом уровень рекомбинационной изменчивости зависит от периода лунной активности, во время которого родительские формы были включены в анализирующее скрещивание.
Введение
Как известно, одно из фундаментальных свойств живых систем – цикличность большинства происходящих в них процессов. Вся жизнь на Земле подчинена определенным ритмам [1]. Огромное влияние на функциональную активность живых организмов оказывают внешние ритмы геофизической природы, связанные с вращением Земли относительно Солнца и Луны относительно Земли. У многих организмов выявлена периодичность, равная лунному месяцу и проявляющаяся в изменении многих физиологических процессов и реакций на внешние воздействия, в частности на факторы электромагнитной природы [1]. Лазерное излучение, в том числе низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение (НИЛИ) ближней инфракрасной области спектра (l=890 нм), широко используемое для лечения различных заболеваний, является ритмическим фактором, обеспечивающим максимально высокую в диапазоне ритмов живых систем частоту [2].  Хронобиологический подход к использованию НИЛИ подразумевает необходимость оптимизации воздействия, синхронизации его с биоритмами организма, приводящей к повышению эффективности и безопасности лазерного облучения [2]. При этом актуальной проблемой остается недостаточность знаний о механизмах биологического действия НИЛИ, в том числе на наследственные структуры клетки и процессы, протекающие с их участием. В связи с выше указанным, целью настоящей работы явилось изучение влияния НИЛИ (l=890нм) и лунных ритмов на частоту мейотической рекомбинации  - универсального генетического процесса, происходящего во время созревания гамет и являющегося одним из источников генотипической изменчивости.
Материал и методы исследования
Оценка рекомбинационной эффективности НИЛИ в разные периоды лунной активности проводилась на плодовой мушке Drosophila melanogaster M. (Drosophilidae, Diptera) линий: Д-32 - «дикий тип» и bcnvg - black (II; 48,5), cinnabar (II; 57,5), vestigial (II; 67,0) [3]. Указанные линии содержались в условиях, обеспечивающих оптимальное развитие особей данного вида [4]. Воздействию НИЛИ подвергали самок-гетерозигот b+cn+vg+/bcnvg на стадии имаго (в возрасте 3-4 суток после вылета). Облучение объекта производили с помощью полупроводникового (As-Ga) инфракрасного (l=890нм) импульсного лазерного аппарата «Узор». Доза лазерного излучения составляла 0,0088 Дж/см2 (мощность излучения 4,1Вт, частота следования импульсов - 80Гц, время экспозиции - 60с). Воздействие НИЛИ происходило в определённые фазы деятельности Луны: III четверть – 6 марта, I четверть – 22 марта, полнолуние – 28 марта и новолуние – 4 ноября.
Во всех случаях опытных и контрольных самок включали в анализирующее скрещивание и помещали на чистую питательную среду в соотношении 4♀:4♂. Родительских особей, включённых в скрещивание, после содержания в пробирках с питательной средой в течение 5-ти суток (в дальнейшем обозначено как I этап исследования) дважды переносили в пробирки с новой питательной средой на 4 суток (II и III этапы исследования), а затем устраняли из опыта. Указанная схема обусловлена временем, проходящим с момента кроссинговера до откладки оплодотворенного яйца. [5].
При оценке уровня рекомбинационной изменчивости были использованы классические методы маркерного анализа [6,7] с учетом дифференциальной жизнеспособности потомства анализирующего скрещивания (Fa) [8,9]. Для количественной характеристики интерференции использовали коэффициент коинциденции (С) [10]. Оценку значимости различий между опытными и контрольными показателями уровня рекомбинации производили по методу c2, коэффициента коинциденции – по td-критерию Стьюдента [11].
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Исследование рекомбинационной эффективности НИЛИ у самок-гетерозигот, облученных в различные фазы лунного цикла, показало, что результат лазерного воздействия (наличие или отсутствие эффекта, а также его знак) в значительной степени зависел от периода лунной активности, во время которого производилось облучение. При этом различные участки генома Drosophila melanogaster (интервалы b-cn, cn-vg и b-vg хромосомы 2) по-разному реагировали на применяемое воздействие.
В интервале b-cn достоверные изменения частоты рекомбинационных событий в сторону ее повышения были отмечены только в двух случаях: на I этапе исследования у самок-гетерозигот, облучённых в полнолуние, и по данным всего периода размножения у особей, облученных в новолуние. В другие фазы лунного цикла используемая нами доза НИЛИ оказалась неэффективной.
В интервале cn-vg НИЛИ оказало рекомбиногенное действие на II этапе исследования только при облучении гетерозигот в новолуние. Вместе с тем, по данным всего периода размножения у самок, облучённых в I четверть лунного цикла, НИЛИ проявило себя как антирекомбиноген, вызвав достоверное снижение частоты кроссинговера.
Наблюдаемые изменения частоты перекреста в районах b-cn  и cn-vg отразились на показателях рекомбинационной активности интервала b-vg. В указанном участке хромосомы 2 НИЛИ активизировало рекомбинационный процесс на I этапе исследования в случае облучения самок-гетерозигот в полнолуние, на II этапе и по данным всего периода размножения – в результате лазерного воздействия в новолуние. При этом согласно суммарным данным трех этапов исследования, индуцированное НИЛИ снижение уровня рекомбинационной изменчивости было отмечено в случае облучения объекта в I четверть лунного цикла.
Несмотря на то, что в ряде случаев исследуемая доза НИЛИ вызывала изменения одинарного кроссинговера, она оказалась неэффективной по отношению к двойному перекресту: при облучении особей во все изучаемые периоды лунной активности его частота достоверно не отличалась от контрольных значений.
Исследование силы взаимного влияния обменов, осуществлявшихся в соседних участках хромосомы 2, показало, что в большинстве случаев НИЛИ не оказывало влияния на генетическую интерференцию. Только в случае облучения объекта в I четверть лунного цикла было отмечено значительное усиление взаимного влияния обменов в интервалах b-cn и cn-vg: на II и III этапах исследования в опыте наблюдалась полная положительная интерференция (С=0) при отрицательной интерференции в контроле.
Сравнение частоты рекомбинации в исследуемых районах хромосомы 2 у контрольных самок позволило обнаружить существенные различия интенсивности протекания рекомбинационных процессов в разные периоды лунной активности.
В интервале b-cn уровень рекомбинации у самок-гетерозигот в I четверть лунного цикла на I этапе исследования достоверно превышал аналогичный показатель в новолуние, на II этапе – частоту перекреста в III четверть. На III этапе исследования статистически значимых различий частоты кроссинговера в разные фазы Луны не было обнаружено. По данным всего периода размножения относительное количество рекомбинантов b+cn и bcn+ в потомстве самок, включенных в скрещивание в I четверть лунного цикла, было выше, чем у особей, приступивших к размножению в III четверть и в новолуние. Частота рекомбинационных событий у самок в полнолуние достоверно превышала относительное количество кроссоверных обменов в III четверть лунного цикла и в новолуние.
В интервале cn-vg на I этапе исследования достоверных изменений рекомбинационной активности в различные фазы Луны отмечено не было. На II и III этапах, а также по результатам трех этапов исследования уровень рекомбинации у самок-гетерозигот в I четверть лунного цикла статистически значимо превышал аналогичный показатель в полнолуние. На III этапе относительное количество рекомбинантов cn+vg и cnvg+ в потомстве самок, включенных в скрещивание в новолуние, достоверно превышало долю указанных кроссоверов в потомстве гетерозигот, начавших размножение в III четверть и в полнолуние. По данным всего периода исследования частота кроссинговера в полнолуние была ниже уровня рекомбинации в остальные периоды лунной активности.
В интервале b-vg на I этапе исследования частота кроссоверных обменов у контрольных самок в III четверть лунного цикла статистически значимо превышала аналогичный показатель в полнолуние и новолуние. На II этапе частота перекрёста у особей, включенных в скрещивание в I четверть Луны, была достоверно выше частоты рекомбинационных событий у самок, приступивших к размножению в полнолуние и новолуние. На III этапе и по данным трех этапов исследования достоверных различий уровня рекомбинации в разные периоды лунной активности отмечено не было.
Частота двойного кроссинговера у контрольных самок на I, II, III этапах исследования статистически значимо не изменялась в изучаемые периоды лунного цикла, однако по данным всего периода размножения относительное количество двойных рекомбинантов в III четверть оказалось ниже, чем в остальные фазы Луны.
Сравнение силы интерференции у контрольных самок показало в большинстве случаев отсутствие достоверных изменений данного показателя в разные периоды лунной активности. Только по результатам всего периода исследования коэффициент коинциденции у самок, включённых в анализирующее скрещивание в I четверть лунного цикла, был статистически значимо выше показателя силы интерференции у особей, приступивших к размножению в III четверть.
Таким образом, организм как сложная энергоинформационная система, управление в которой осуществляется с помощью частотной модуляции [2], взаимодействует с внешними ритмами движения Луны вокруг нашей планеты. При этом исследуемые показатели рекомбинационной изменчивости как результат совокупности сложных многоэтапных процессов, осуществляющихся на различных уровнях организации живой системы [12] и характеризующихся собственной частотой [13], также подчинены лунным ритмам. Воздействие такого фактора ритмической природы, как НИЛИ, на сложную иерархию ритмических биологических процессов, протекающих в живом организме, может привести к различным биологическим последствиям в зависимости от исходного физиологического (ритмического) состояния энергоинформационной системы – организма. Исследование зависимости функционального состояния организма, его репродуктивной системы и наследственных структур клеток от внешних ритмов геофизической природы (в том числе периодов лунной активности) является необходимым для выбора оптимальной и безопасной методики лазерного воздействия.

 
Литература
1.      Чернова Н.М., Былова А.М. Экология. – М.: Просвещение, 1988.- 272с.
2.      Москвин С.В., Буйлин В.А. Оптимизация лазерного воздействия /Низкоинтенсивная лазерная терапия. – М.: ТОО «Фирма «Техника», 2000. – С. 141-209.
3.      Lindsley D.L., Grell E.N. Genetic Variation of Drosophila melanogaster.- Carnegie Inst. Wash. Publ., 1968.- №627.- 471p.
4.      Медведев Н.Н. Практическая генетика. - М.: Наука, 1968.- 294с.
5.      Проблемы генетики в исследованиях на дрозофиле / Под ред. Н.Н. Хвостовой.- Новосибирск: Наука, Сибирское отд., 1977.- 248с.
6.      Бейли Н. Математика в биологии и медицине.- М.: Мир, 1970.- 326с.
7.      Bailey N.T.J. Introduction to the Mathematical Theory of Genetic Linkage.- Oxford: Clarendon Press, 1961.- 298p.
8.      Kuspira J., Bhambhani R.N. A Simple Method for Estimating Recombination Percentages and Linkage Intensities from F2 Data: Examples from Triticum monococcum and Other Self-Fertilizing Diploid Plant Species // Theor. Appl. Genet.- 1984.- V.68, №112.- P.61-67.
9.      Rahman N.A. Estimation of Linkage with Censored Data // Heredity.- 1964.- V.19, №3.- P.512-515.
10. Stevens W.L. The Analysis of Interference // J. Genet.- 1936.- V.32.- P.56-64.
11.  Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биолог. спец. вузов. – М.: Высш. шк., 1990. – 352 с.
12. Жученко А.А., Король А.Б. Рекомбинация в эволюции и селекции.- М.: Наука, 1985.- 400с.
13.  Биологические ритмы: в 2-х т. Т.1 / Под ред. Ю. Ашоффа.- М.: Мир, 1984.-414с.