Нейрофиламенты являются важным компонентом цитоскелета аксонов и дендритов нейронов. Они представлены тремя нейрон-специфичными протеинами с молекулярными массами 68 kD (NF-L, легкая цепь нейрофиламента), 125 kD (NF-M, средняя цепь), и 200 kD (NF-H, тяжелая цепь). Вероятно, NF-L играет ведущую роль при сборке белковых субъединиц в нейрофиламенты, а так же принимает участие в регуляции экспрессии других нейрофиламентных протеинов. Считается, что около 2 % семей с нейропатией Шарко-Мари-Тус (Charcot-Mary-Tooth, CMT) могут нести мутации в гене NF-L [1]. Нейрофиламенты относятся к цитоплазматическим промежуточным филаментам (IF). Разные типы IF имеют общие структурные характеристики, а их гены - сходное строение. Гены виментина (IF клеток мезенхимального происхождения), десмина (IF мышечных клеток) и глиального фибриллярного кислого белка (IF астроцитов), содержат по 8 интронов в идентичных позициях, 6 из них были локализованы внутри региона, кодирующего альфа-спиральную последовательность белка. Большинство интронов в филогенетически более удаленных кератиновых (IF эпителиальных клеток) генах находятся в сходных или идентичных позициях. Ген NF-L, описанный Julien и др. (1987), содержит только 3 интрона, отличаясь, тем самым, от остальных промежуточных филаментов. Такое же строение характерно и для других нейрофиламентов [1].
Нами была исследована ДНК больных с диагнозом CMT и их родственников из Таджикистана и Сибирского региона, всего проанализировано 47 семей. Поиск мутаций проводили с помощью SSCP-анализа. Этот метод позволяет выявлять точечные замены во фрагментах ДНК небольшого размера (оптимум - 200-300 п. н.). Как уже говорилось, ген NF-L состоит из 4х экзонов, нами были исследованы 2 из них. Первый экзон довольно велик, поэтому он был разделен на 6 перекрывающихся фрагментов, которые и были нами проанализированы. Таким образом, всего к настоящему моменту проанализировано 7 фрагментов данного гена. Амплификацию проводили с праймерами, описанными ранее [4]. Перед внесением в гель пробы подвергали щелочной денатурации. Разделение цепей проводили в нескольких различающихся условиях. Для подбора оптимальных условий разгонки нами варьировались соотношения акриламида к бисакриламиду (29:1; 39:1; 49:1), процентность геля (10-15 %) и содержание глицерина в геле (5-10 %). Каждый фрагмент был проанализирован как минимум в двух разных условиях. Изменений подвижности одноцепочечных фрагментов, свидетельствующих о наличии нуклеотидных замен, выявлено не было.
Мутации в гене NF-L, приводящие к СМТ, были впервые описаны в России. Мерсиянова с (2000) описали большую семью (6 поколений) из России с аутосомно-доминантной CMT2. Заболевание проявлялось во второй или третьей декаде жизни, характеризуясь затруднениями при ходьбе, слабостью и атрофией дистальных мышц нижних конечностей и, в различной степени, деформациями стоп (pes cavus). У пораженных индивидов не был выявлен ряд клинических признаков, характерных для уже описанных форм СМТ2. Некоторые пациенты имели гиперкератоз, хотя не было найдено четкой ассоциации между этими заболеваниями. Новая форма была названа CMT2E [4]. Позже, Georgiou с соавт. (2002) описали семью с CMT2E из Словении, включающую 5 поколений. Болезнь у большинства пациентов начиналась в первой декаде жизни. Первыми симптомами были затруднения при ходьбе и беге, возникающие из-за медленно прогрессирующей дистальной слабости и атрофии в нижних конечностях. В типичном случае были представлены походка типа степпаж, pes cavus, и скрюченные пальцы ног. Через 20 лет и более после начала болезни у двух третей пациентов развивалось вовлечение в патологический процесс верхних конечностей, заключающееся в искривлении кистей по типу "обезьяньей лапы". У всех пациентов сохранялась полная подвижность даже через 20-30 лет после начала заболевания [2].
Годом позже, Jordanova и др. (2003) описали 3 семьи с аутосомно-доминантной CMT1, в которых были выявлены мутации в гене NF-L. Болезнь начиналась в детстве или младенчестве (от 1 до 13 лет) со слабости и атрофии дистальных мышц конечностей, с более сильным поражением нижних конечностей; дистальной сенсорной недостаточности, снижения рефлексов, искривления стопы, и редукции проведения моторного нервного импульса (NCV). Также были описаны три спорадических случая, со сходными клиническими картинами у больных. Биопсия нервов одного из пациентов показала потерю миелинизированных фибрилл, формирование "луковичных головок", нерегулярных миелиновых складок и кластеры аксональной регенерации. Эту форму аутосомно-доминантной демиелинизирующей СМТ, вызываемой мутациями в гене NF-L назвали CMT1F [3].
К настоящему моменту в гене NF-L описано 24 нуклеотидных замены и 1 делеция; из них 3 являются мутациями, приводящими к СМТ2Е, 6 - к СМТШ, 1 - к неспецифичному для СМТ фенотипу, а остальные -являются полиморфными вариантами [5].
Таким образом, мы видим, что как и в случае с мутациями в генах Р0 и Cx32, мутации в гене NF-L могут приводить к нейропатии Шарко-Мари-Тус и I типа (демиелинизирующего), и II (аксонального). Стоит отметить, что хотя демиелинизация является патологическим физиологическим маркером СМТ1, ее клинические признаки - мышечная слабость и сенсорная недостаточность - являются результатом не демиелинизации, а последующей дегенерации аксонов. Например, скорость проведения нервного импульса у детей с СМТ1 снижена еще до проявления первых симптомов болезни, и эта скорость не изменяется значительно с прогрессией заболевания. Нарушения в цитоскелете нейронов при мутациях в NF-L приводят к аксональной дегенерации, в том числе - к уменьшению диаметра аксонов, что приводит к нарушениям иннервации соответствующих мышц. Остается вопрос, почему разные мутации в одном гене приводят к столь различным начальным фенотипическим и патологическим проявлениям.
Как и остальные члены семейства промежуточных филаментов, нейрофиламенты имеют общую структурную организацию, включающую центральный альфа-спиральный стержневидный домен, который фланкирован N-терминальным головным и C-терминальным хвостовым доменами. Центральные стрежневидные домены облегчают формирование попарно скрученных олигомеров, которые затем собираются в филаменты диаметром 10 нм. Существует высокая консервативность N-терминального головного домена от Xenopus до млекопитающих. Полагают, что N-терминальный головной домен регулирует сборку протеинов в филамент, а C-терминальные хвостовые домены NF-M, NF-H (которые длиннее, чем NF-L) формируют боковые "ручки", которые выступают из филамента и способны формировать разводки между нейрофиламентами и другими органеллами аксоплазмы [1]. Brownlees с соавт. (2002) продемонстрировали, что две (NF-LPro8Arg и NF-LGln333Pro) мутации в NF-L разрушают сборку нейрофиламентов и аксональный транспорт. Однако эффекты разных мутаций NF-L при СМТ на сборку и архитектуру нейрофиламентов остаются неизвестными [1].
Эксперименты на нокаут-мышах по гену NF-L показали, что, отсутствие белка NF-L приводит к сильной редукции уровня NF-M и NF-H белков в головном мозге и седалищном нерве, хотя было определено повышение уровня других белков цитоскелета. Не смотря на отсутствие нейрофиламентов и гипотрофию аксонов, NF-L-нокаут мыши развивались нормально. Однако и у гомозиготных и у гетерозиготных по мутациям в NF-L мышей отсутствовала нормальная регенерации миелинизированных нервных волокон после их разрушения. Процесс регенерации в этом случае очень сильно замедлен, а значит, нейрофиламент играет роль в созревании регенерирующих миелинизированных аксонов [4]. Nguen с соавт. (2001) предположили, что нейрофиламенты в моторных нейронах могут играть роль в фосфориляции, ингибируя активность белков, проводящих ее, редуцируя тем самым вредную гиперфосфориляцию нейрональных субстратов [1].
Нарушения в метаболизме нейрофиламентов является частью патогенеза в ряде нейродегенеративных заболеваний. Так, например, разрушение аксонального транспорта нейрофиламентов является одной из ранних патологических картин в трансгенной модели амиотрофического латерального склероза и является первичным патогенетическим механизмом, который индуцирует болезнь. Мутации в NF-L также нарушают транспорт митохондрий по аксонам, приводя к их аккумуляции в теле клетки и проксимальной части аксона. В целом, нейроны являются высоко поляризованными клетками с органеллами, везикулами и другими протеиновыми комплексами, требующими после синтеза транспортировки в соответствующее место локализации. И расстояния таких перемещений могут быть значительными, например, аксоны моторных нейронов человека могут достигать 1 м в длину. Аккумуляция митохондрий в телах клеток и проксимальной части аксонов при СМТ четко указывает на то, что поставка метаболической энергии в более дистальные регионы аксонов и дендриты нарушена. Что, в свою очередь, нарушает функционирование АТФ-аз кинезина (осуществляющего транспорт к кончику аксона) и динеина (осуществляющего транспорт к телу аксона), и таким образом нарушается снабжение аксоплазмы ее существенными компонентами. Возможно, что это является механизмом нейрональной клеточной гибели при СМТ [1]. Интересно, что мутации в другом гене - KIF1bB, выявленные при СМТ2А, также влекут нарушение аксонального транспорта, приводящие к развитию заболевания.