Научный руководитель: канд. биол. наук, доц. В.И. Минина

Институт экологии человека СО РАН, г. Кемерово

Эта работа была опубликована в cборнике материалов I Всероссийской научной студенческой конференции с международным участием «МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ», под редакцией проф., д-ра мед. наук С.И. Карася (г. Томск, 10-11 ноября 2011 года). 

Введение. Рак легкого (РЛ) занимает лидирующее положение в структуре онкологической заболеваемости мужчин в мире, в России и Кемеровской области. В разных географических регионах среди мужчин ежегодно регистрируется от 5,3 до 99,7 новых случаев РЛ на 100000 че­ловек в год. В России ежегодно от РЛ погибает свыше 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей [1]. Развитие злокачественной опухоли — многофакторный и многоста­дийный процесс, в основе развития которого лежит сочетанное воздей­ствие экзогенных и эндогенных факторов. Для РЛ наиболее важными эк­зогенными факторами считаются: курение, загрязнение окружающей и производственной среды, воздействие излучений радона и продуктов его распада. К эндогенным факторам следует отнести индивидуальные особенности функционирования защитных систем организма (система метаболизма ксенобиотиков, репарации ДНК, иммунная система и др.), эффективность работы которых генетически детерминирована.

Гены GSTM1 и GSTT1 вовлечены в детоксикацию мутагенных про­межуточных метаболитов, образующихся в организме, под действием ферментов первой фазы биотрансформации. У человека GSTM1 лока­лизован на 1 хромосоме в области 1р13.3. GSTT1 осуществляет деток-сикацию, главным образом токсичных галогенпроизводных углеводоро­дов, в избытке содержащихся в атмосфере. GSTT1 картирован на 22 хромосоме в локусе 22q11.2. Генотип GSTM1 0/0 повышает чувстви­тельность к химическим канцерогенам, предрасполагает к раку легких. В целом, данные литературы говорят о том, что нулевой вариант гена GSTM1 предрасполагает к тем видам злокачественных образований, для которых в качестве этиологического фактора служит табачный дым (tobacco-linked cancers), в то время как для GSTT1 0/0 такая связь в большинстве случаев не характерна [5].

В ряде работ показано, что функциональную значимость в развитии онкопатологии может иметь не один конкретный рисковый генотип, а их специфическая комбинация. Например, было отмечено, что повышен­ный риск РЛ у курильщиков европеоидной расы имеют индивиды с ком­бинацией генотипов GSTM1-нуль, GSTP1 AG+GG и GSTM3 AA [4]. Мно­гообразие и противоречивость литературных данных относительно ас­социаций между полиморфизмом генов GST и риском РЛ, влияние на результаты исследований множества «дополнительных» факторов (та­ких как национальность, вредные привычки, воздействие факторов окружающей среды, а также влияние полиморфных вариантов других генов) обусловливает необходимость продолжения подобных исследо­ваний. Особую актуальность приобретает изучение роли полиморфных маркеров генов в формировании риска РЛ в популяциях, подвергаю­щихся интенсивному воздействию канцерогенных факторов. Примером могут служить группы жителей Кемеровской области, на территории ко­торой активно ведется угледобыча, приводя к мощному техногенному загрязнению окружающей среды.

В связи с этим, целью данного исследования стало изучение поли­морфизма генов GST у больных раком легкого и здоровых людей, про­живающих в Кемеровской области.

Материал и методы. В программу исследования были включены 367 мужчин. Из них в исследуемую группу вошло 242 человека больных раком легкого, поступивших на лечение в Кемеровский областной онко­логический диспансер. Группу сравнения составили 125 здоровых лю­дей, также проживающих в Кемеровской области и не имеющих онколо­гических заболеваний. Средний возраст в группах составляет 50 лет.

Для выполнения молекулярно-генетических исследований у всех обследованных доноров была забрана венозная кровь на антикоагулян­те (0,25 мМ ЭДТА-Na), с последующим получением лейковзвеси. Выде­ление ДНК из этого биологического материала проводилось методом фенол-хлороформной экстракции. Образцы ДНК растворяли в 10 mM Tris/1 EDTA, pH 8.0 и хранили при -20^o C. Тест-системы для молекуляр-но-генетического анализа полиморфизмов GSTM1 и GSTT1 разработа­ны ИХБФМ СО РАН (г. Новосибирск).

Типирование генов GSTM1 и GSTT1 проводили методом мульти­плексной ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в режиме ре­ального времени. Для исключения отсутствия флуоресцентного сигнала в связи с отсутствием ДНК или ингибированием ПЦР в реакционные смеси добавлялись в качестве внутреннего контроля ПЦР праймеры LTM (low temperature melting) (5'-TGGGTGCTAGAGGTATAATCG-3' и 5'-TTAGAGGAAGCTGGGTAAGAG-3'). Амплификацию осуществляли с применением методики hot-старт, при этом праймеры и dNTP с помо­щью парафина отделяются от ДНК и Taq-полимеразы. Амплификацию проводили с помощью амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация 2 мин при 95°С, далее 40 циклов при следующих условиях: денатурация 10 сек. при 95°С, отжиг праймеров 10 сек. при 66°С, элонгация 10 сек. при 72°С, регистрация флуоресцентного сигнала 10 сек. при 78°С, затем 10 сек. при 85°С. Затем регистрировали кривые плавления: 60 циклов по 10 сек. с повышением температуры на 0,5°С в каждом цикле - начальная тем­пература составила 65°С для GSTM1+LTM и 70°С для GSTT1+LTM, ре­гистрацию флуоресцентного сигнала производили в каждом цикле. По­лученные результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флуоресценции, специфичность оценивалась с помощью кривой плавления. Температура плавления составляла 85°С для GSTM1 и 91°С для GSTT1 . Отсутствие флуоресцентного сигнала указывало на гомозиготность индивидуума по делеции гена («0»). Гетерозиготы по му­тации (генотип «+/0») рассматривались в одной группе с носителями нормальных генов («+»).

Статистическая обработка результатов проводилась с использова­нием пакета прикладных программ «STATISTICA for Windows 6.0». При сравнении частот генотипов применяли стандартный критерий х2 Пир­сона. При условии, когда объем выборки не превышал 10 случаев, ис­пользовали критерий х2 с поправкой Йетса (Y), когда объем выборки не превышал 5 случаев - критерий Фишера (F). Различия статистически значимы при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Частота встречаемости генотипа GSTT-null в группе больных Рл составляет- 21,9%, тогда как в группе сравне­ния- 31,06%. Наблюдаемые различия оказались статистически недосто­верными (р = 0,677).

Частота встречаемости генотипа GSTM-null в группе больных РЛ со­ставляет- 35,9%, тогда как в группе сравнения- 41,6%. Наблюдаемые различия так же оказались статистически недостоверными( р = 0,345). Анализ комбинаций генотипов GSTT и GSTM не показал достоверных отличий частоты их встречаемости в группах РЛ и здоровых доноров.

По данным современной литературы, GSTM1-null генотип оценива­ется как вероятный фактор риска для развития РЛ. Но для некоторых популяций статистическая значимость ассоциаций подтверждена не бы­ла. Так, например, в бразильской популяции не находили значимого увеличения риска развития РЛ, связанного с 0/0- генотипом GSTM1 [3]. Литературные данные по полиморфизму гена GSTT1 при РЛ противоре­чивы. Увеличение частоты нулевого аллеля отмечено у китайской, ази­атской популяций, у жителей Мексики, Индии, Дании, у европеоидов GSTT1*0 увеличивал риск для аденокарциномы и плоскоклеточной формы РЛ. В ряде работ показано, что функциональную значимость в развитии онкопатологии может иметь не один мутантный генотип, а их специфическая комбинация. Было отмечено, что риск РЛ увеличивается для людей, одновременно несущих делецию генов GSTM1 и GSTT[2].

Выводы. Ассоциаций между делеционными полиморфизмами ге­нов GSTT1 и GSTM1 и риском развития рака легкого в Кемеровской по­пуляции не обнаружено, что может быть как особенностью данной вы­борки, так и недостаточным объемом исследованных групп.

Список литературы:

Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т. Статистика рака легкого (заболеваемость,смертность, выживаемость) // Практич. oнкол. -2000. - Т. 3. - С. 3-7.

2.             Cajas-Salazar N., Sierra-Torres C.H., Salama S.A. et al. Combined effect of MPO, GSTM1 and GSTT1 polymorphisms on chromosome aberrations and lung cancer risk // Int. J. of Hygiene and Env. Health. - 2003. - V. 206, Iss.6. - P. 473-483.

4.             Jourenkowa-Mironova N., Wikman H., Bouchardy C. et al. Role of glutathione S-transferase GSTM1, GSTM3, GSTP1 and GSTT1 genotypes in modulating suscepti­bility to smoking-related lung cancer // Pharmacogenetics. - 1998. - V. 8. - P. 495­502.

5.              Saarikoski ST, Voho A, Reinikainen M. et al. Combined effect of polymorphic GST genes on individual susceptibility to lung cancer // Int. J. Cancer. - 1998. - Vol. 77. -P.516-521.