Институт общей генетики им Н.И.Вавилова ( г. Москва)

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

        Методом ПЦР-анализа изучен полиморфизм нуклеотидной последовательности гипервариабельной области интрона 7, содержащей мини-сателлитные повторы  (локус IVS7), гена фактора VII свертывания крови в выборках здоровых индивидов в четырех популяциях: монгольской, эвенкийской, тувинской и московской, а также полиморфизм микросателлитного локуса гена липопротеинлипазы (humLPL) в популяциях эвен-ков, тувинцев и москвичей.
Обнаружен полиморфизм локуса IVS7 в популяциях монголов (аллели H6 и H7), тувинцев и эвенков (H6, H7, H5), и русских г. Москвы (H6, H7 и H8). Обнаружены три неизвестные ранее точечные мутации, локализованные в области минисателлитного повтора интрона 7 у индивида с гено-типом Н7/Н7 в выборке из Тувы. Выявлена гетерогенность изученных популяций человека по полиморфизму IVS7 гена фактора VII. Распределе-ние частот аллелей IVS7 в популяциях различного происхождения обсуждается в связи с риском сердечно-сосудистых заболеваний. Выявлен этноспецифический характер распределения микросателлитных аллелей гена humLPL.
Введение
В настоящее время большое количество медико-генетических и популяционных исследований сфокусировано на изучении полиморфизма ге-нов, ассоциированных с риском возникновения сердечно-сосудистых болезней. Одним из таких генов является ген липопротеинлипазы (humLPL).  Липопротеинлипаза является важным звеном метаболизма липидов и осуществляет гидролиз триглицеролов в составе хиломикрон, освобождая при этом жирные кислоты [1].  Известно, что мутации гена humLPL вызывают изменение уровня и активности липопротеинов и приводят к гипер-липопротеинемии и риску развития атеросклероза. В настоящее время показана связь некоторых полиморфных областей  гена LPL с развитием острого инфаркта миокарда [1, 2].
     Фактор VII (FVII) свертывания крови человека является витамин К–зависимой плазматической  сериновой протеазой (проконвертин), кото-рая играет ключевую роль в процессах коагуляции крови. Повышение уровня активированного FVII (FVIIa) в плазме ассоциировано с увеличени-ем риска многих сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе инфаркта-миокарда и ишемической болезни сердца; в то время как дефицит фак-тора VII приводит к нарушению процессов свертывания крови и возникновению одной из форм гемофилии у человека [3]. Недавно было показа-но, что полиморфизм, обусловленный различиями в количестве копий минисателлитных повторов в гипервариабельной области интрона 7 (локус  IVS7) влияет на изменение плазматического уровня FVIIa; определенные   IVS7-генотипы тесно ассоциированы с риском летального инфаркта-миокарда [3, 4]. Кроме того, в последнее время появились исследования, подтверждающие связь полиморфных минисателлитных областей генов с определенными заболеваниями человека, такими, например, как диабет и др. [5].
           Таким образом, ген фактора VII и  humLPL могут служить информативными маркерами для изучения и диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Следует учитывать, что сердечно-сосудистые заболевания в разных популяциях  могут быть обусловлены своеобразной комбинацией генетических и средовых факторов. Эти заболевания относятся к многофакторным заболеваниям  и для них связь между генетиче-скими особенностями и вероятностью развития патологии  гораздо сложнее по сравнению с моногенными заболеваниями. Для установления дос-товерных коррелятивных связей конкретных аллелей гена с тем или иным сердечно-сосудистым заболеванием необходимо знать особенности распределения этих аллелей в различных популяциях человека.
     Целью нашего исследования было изучение микросателлитного (STR) полиморфизма   humLPL  и минисателлитного (VNTR) полиморфизма гипервариабельного локуса IVS7 гена фактора VII в московской и монгольской популяциях, а также в популяциях коренных народов Сибири с помощью ПЦР-анализа.
Материалы и методы.
        Образцы крови были получены от добровольцев, проживающих на территории двух стран России и Монголии. Образцы крови собирались среди индивидов монгольской, эвенкийской, тувинской национальности. Этническая принадлежность исследованных индивидов выяснялась с помощью анкетирования, при этом считалась существенной принадлежность к указанной этнической группе в 3-м поколении. По такому же принципу были собраны образцы крови   среди русских жителей г. Москвы.  
        ПЦР-анализ микросателлитного полиморфизма тетрануклеотидных повторов в интроне 6 гена humLPL  проводили по методике   описан-ной в “GenPrint STR Systems (Silver Stain Detection)”, Technical Manual No. D004. (Promega Corporation).  
Для изучения полиморфизма  локуса IVS7 гена фактора VII были подобраны следующие олигонуклеотидные праймеры: 7FG1- TGCAATGCCAGAGGTTCCTTG, 7FG2- GTGGAAGTGACAGCACGAAGC, позволяющие амплифировать фрагмент длиной 489 п.н. (с 10027 по 10515 нп., в случае аллеля H6), который включал участки экзона 7 и интрона 7 с минисателлитными повторами (согласно нуклеотидной последо-вательности гена фактора VII по O'Hara et al.1987 [6]). ПЦР проводили на термоциклере “PTC-100TM MJ Research, Inc.” (USA) c использованием набора реагентов для PCR-амплификации ДНК MiniTaq TM (Биоком, Россия). В реакционную смесь объемом 25 мкл вносили по 50 нг каждого праймера и 100 нг геномной ДНК, а также 1.5 е.а. Taq-полимеразы. PCR-амплификацию проводили в следующем режиме: денатурация – 95С –0,8 мин., отжиг праймера – 60С – 1 мин., синтез ПЦР-продукта – 72С – 1,5 мин. (всего 35 циклов). Реакцию заканчивали на стадии синтеза 10 мин. ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мкл).          Секве-нирование очищенных ПЦР-образцов проводили на автоматическом секвенаторе.

Результаты и обсуждение.

 Частоты аллелей минисателлитного локуса IVS7 и микросателлитного локуса humLPL представлены в таблицах 1 и 2, соответственно.

Таблица 1. Частота аллельных вариантов минисателлитного локуса IVS7.

Популяция	N	Частота      аллелей
		H5	H6	H7	H8
Монголы	29	0	0.431	0.569	0
Эвенки	23	0.043	0.522	0.435	0
Тувинцы	39	0.013	0.385	0.602	0
Русские г. Москвы	48	0	0.417	0.448	0.135

 

Таблица.2 Частота аллельных вариантов микросателлитного локуса humLPL в различных популяциях.

Популяция	N	Aллели локуса humLPL
		7	8	9	10	11	12	13	14
Русские г. Москвы	51	0	0	0.038	0.368	0.245	0.321	0.028	0
г.Новосибирск*	95	0	0	0.016	0.453	0.263	0.237	0.032	0
Тувинцы**	129	0	0.004	0.031	0.729	0.140	0.097	0	0
Тувинцы	10	0	0	0	0.700	0.150	0.150	0	0
Эвенки	6	0	0	0	0.666	0.167	0.167	0	0

* по данным работы  [12]

** по данным работы Кучер и др., 2003 [13]

        Функциональная роль различного числа тандемных минисателлитных повторов в локусе IVS7 состоит в модуляции экспрессии гена фак-тора VII [3]. Ранее было выявлено, что аллель Н7 локуса IVS7 обуславливает устойчивость к возникновению инфаркта у больных различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, т.к. ассоциируется низким (в пределах нормы) уровнем фактора VII в крови, что является защитным фи-зиологическим эффектом от инфаркта миокарда Пациенты ИБС с генотипом H7/H7 имеют пониженный риск инфаркта миокарда [4, 7]. Сущест-вуют особенности распределения аллелей и генотипов  фактора VII в различных популяциях. Описаны различия между европейскими популя-циями в распределении аллелей  локуса IVS7, связанных с низкими уровнями фактора VII, причем различия усиливаются c севера на юг [4]. Наши исследования также выявили межпопуляционные различия по распределению аллельных вариантов IVS7. Результаты наших исследований пока-зывают, что частота аллеля H7 в московской популяции относительно высокая и сходна со средней частотой распространения этого аллеля в по-пуляциях, проживающих в южных областях Западной Европы (Испания, Италия, Франция) (0,43). В этих популяциях отмечен относительно низ-кий уровень сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда, по сравнению с популяциями Северной Европы, где отмечена сред-няя частота аллеля H7 (0.290) [4, 8, 9]. В московской популяции выявлена относительно высокая частота аллеля H8, который ассоциирован с по-вышенным уровнем FVIIa  в крови и возможно с риском возникновения инфаркта миокарда [3]. Однако в других изученых популяциях этот ал-лель относился к разряду редких и риск развития  сердечно-сосудистых заболеваний, связанный с присутствием его в генотипе индивидуума, необходимо изучать дополнительно.
       Выявленная средняя частота  аллеля Н7 в популяциях Сибири и Монголии (0.535)  значительно выше европейских показателей, что кос-венно подтверждает данные о невысоком распространении сердечно-сосудистых заболеваний у монголоидов [9,10]. Оценки частот аллеля устой-чивости к инфаркту Н7 у коренных народов Сибири (тувинцы и эвенки) демонстрируют сходство с распределением этого аллеля в популяции эскимосов, проживающих в Гренландии, где отмечен один из самых низких уровней сердечно-сосудистых заболеваний в мире [9].
          В нуклеотидной последовательности  фрагмента гена F7 у представителя тувинской популяции  с  генотипом Н7/Н7 впервые обнаружены три новых мутации в области минисателлитных повторов интрона 7 (две транзиции T/C в положении 10299 п.н. и 10455 п.н., и одна трансверсия G/C в положении 10412 п.н. (нуклеотидные позиции даны по нуклеотидной последовательности (№ J02933 GenBank)) [6].
             Изучение распределения аллелей для тетрануклеотидного повтора в интроне 6 гена humLPL выявило присутствие пяти аллелей  (9, 10, 11, 12, 13) в московской популяции и трех аллелей (10, 11, 12) в тувинской и эвенкийской популяциях (табл.2). Распределение аллельных вариан-тов гена humLPL в выборке русских из московской популяции демонстрирует сходство с распределением аллелей в выборке из популяции г.Новосибирска (табл. 2)[12]. Популяционные частоты аллелей в выбоке тувинцев в нашем исследовании близки с оценками частот, выявленными ранее (табл. 2) [13]. Спектр аллелей humLPL, выявленный нами в популяции эвенков и тувинцев, характерен для выборок из монголоидных попу-ляций.  В настоящее время изучение полиморфизма тетрануклеотидных повторов (STR) широко применяется для генетического картирования наследственных заболеваний человека, а также в судебной медэкспертизе для идентификации личности.
          Таким образом, наше исследование позволило выявить различный спектр распределения полиморфных аллелей локуса локуса IVS7 в по-пуляциях народов Сибири, Монголии и московской популяции, и продемонстрировать информативность изучения минисателлитного ДНК-маркера гена фактора VII в популяциях человека различной этнической принадлежности в связи с риском сердечно-сосудистых заболеваний. Установлен этноспецифический характер распределения микросателлитных аллелей гена липопротеинлипазы.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта РФФИ № 01-04-48441, ФЦНТП (раздел «Технологии живых систем», контракты «Базы данных о генофондах человека, животных, растений и микроорганизмов» и «Сохранение и генетический мониторинг генофондов человека, жи-вотных, растений и микроорганизмов”).

Список литературы
 1. Hokanson J.E. Lipoprotein lipase gene variants and risk of coronary disease: a quantitative analysis of populationbased studies. Int. J. Clin. Lab. Res. 1997. V.27 (1), pp. 24-34.
2. Shagisultanova EI, Mustafina OE, Tuktarova IA, Khusnutdinova EK. HindIII polymorphism of lipoprotein lipase gene and risk of myocardial infarction. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2001.N.3,pp.18-22.
3. M. Pinotti, R. Toso, D. Girelli, D.  et al. Modulation of factor VII levels by intron 7 polymorphisms: population and in vitro studies. Blood. V. 95, N. 11, 2000, pp. 3423-3428.
4. Iacoviello L, Di Castelnuovo A, de Knijff P, et al. Polymorphisms in the coagulation factor VII gene and the risk of myocardial infarction. N. Engl. J. Med .1998; pp. 338:79-85.
5. Krontiris TG. Minisatellites and human disease. Science. 1995, V. 269, pp. 1682-1683.
6. O'Hara PJ, Grant FJ, Haldeman BA, et al. Nucleotide sequence of the gene coding for human factor VII, a vitamin K-dependent protein participating in blood coagulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1987. V.84, pp. 5158–5162.
7. Di Castelnuovo A, D'Orazio A, Amore C, et al. Genetic modulation of coagulation factor VII plasma levels: contribution of different polymorphisms and gender-related effects. L.Thromb. Haemost. 1998. V. 80 (4), pp. 592-597.
8. Batalla A, Alvarez R, Reguero JR, et al. Lack of association between polymorphisms of the coagulation factor VII and myocardial infarction in middle-aged Spanishmen. Int. J. Cardiol. 2001. V. 80(2-3), pp. 209-212.
9. M.P.M. de Maat; F. Green; P. de Knijff; et al. Factor VII polymorphisms in populations with different risks of cardiovascular disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 1997. V. 17, pp. 1918-1923.
10. K. Shimokataa, T. Kondoa, M. Ohnob, et al. Effects of coagulation Factor VII polymorphisms on the coronary artery disease in Japanese: Factor VII polymorphism and coronary disease. Thrombosis Research. 2002. V. 105, pp. 493.
11. Kario K, Narita N, Matsuo T, et al. Genetic determinant of plasma FVII activity in the Japanese. Thromb. Haemost. 1995. V. 73, pp. 617–622.
12. Тимофеева О.А., Филипенко М.Л., Аульченко Ю.С., Воронина Е.А., Масленников А.Б., Мертвецов Н.П. Анализ распределения аллелей тетрануклеотидного по-втора в интроне 6 гена липопротеинлипазы среди населения г. Новосибирска. Генетика, 1999. Т. 35. № 6, с. 862-864.
13. Кучер А.Н., Ондар Э.А., Степанов В.А. и др. Тувинцы: гены, демография, здоровье. Томск, Печатная мануфактура, 2003. 231 с.