Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2006 год, Том 3, выпуск 1), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

При разработке препаратов для диагностики кампилобактериоза одной из главных задач является выделение и очистка высокоактивных антигенных фракций. Извлечение антигенов из микробных клеток может быть осуществлено с помощью физических и химических методов, таких как температурное воздействие, ультразвук, Y - излучение, баллистическая дезинтеграция, Х – пресс дезинтеграция; экстракция фенолом, этанолом, ТХУ и т.д. Выделяемые при этом комплексы имеют разнообразный спектр антигенов с различными физико-химическими и иммунохимическими свойствами.
Целью данной работы явилось получение высокоактивных антигенных фракций из бакмасс возбудителя кампилобактериоза.
В работе использовали бакмассу кампилобактериоза, обеззараживали  и получали водорастворимые антигены по методу Е.Н. Афанасьева (1984). Количественное определение белка проводили по методу O.Warbyrg, W.Christian  (1941). Сравнение спектров поглощения водорастворимых белковых антигенов осуществляли при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989). При иммунизации использовали схемы, разработанные И.С.Тюменцевой с соавт. (1994). Анализ антигенного состава микроорганизмов и качество полученных иммунных сывороток проводили в реакции преципитации в 1 % агаровом геле по O.Ouchterloni (1949). Иммуноглобулины фракционировали ПЭГ-6000 (Polsen et al., 1964). Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.K.Nakane, A.Kawaoi (1974). Рабочий титр конъюгата определяли методом двойного антительного "сэндвича" по методике Clark, Adams (1977). Результаты учитывали на регистрирующем спектрофотометре "Multiscan" (Флоу лаб, Англия).
Технология получения водорастворимых  антигенов состояла из следующих этапов: фракционирование сернокислым аммонием, механическая дезинтеграция, ультразвуковая дезинтеграция.
Обеззараженную и проверенную на специфическую стерильность бактериальную  массу  возбудителя кампилобактериоза центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин на центрифуге "Beckman L-75". После центрифугирования отделяли супернатант от осадка. Для фракционирования белков в супернатант добавляли сульфат аммония до 80 % насыщения и  перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин. Полученный раствор оставляли на 16-18 часов при 4 0С для  формирования   осадка   и   стабилизации белка. Центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин, супернатант удаляли, а осадок содержащий антиген, растворяли в  0,9  %  растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1 и проводили диализ против водопроводной, а затем дистиллированной воды до отсутствия ионов NH2+,  определяемых реактивом Несслера. Экстракция осадка раствором NaCl и выделение второго супернатанта позволяет в максимальной степени извлечь антигены кампилобактериоза из бактериальной массы. Фракционирование антигенов из супернатантов сульфатом аммония, помимо концентрирования и очистки, приводит к стабилизации белков.  Таким способом выделяли поверхностные белки  микроба.
Осадок, полученный  после  центрифугирования  бактериальной массы и  растворенный  в 0,9 %  растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, в объеме 30 мл помещали в камеру Х-пресс дезинтегратора,  предварительно охлажденного в течение 2-4 часов при температуре минус 40 0C.  Микробные клетки в дезинтеграторе замораживали  при  той же температуре в течение 8 часов. После этого проводили разрушение клеток на гидравлическом прессе, четырехкратно  продавливая  бакмассу через калиброванное отверстие патрона дезинтегратора. Далее биомассу размораживали и центрифугировали при 20 000 g в течение 30 минут. В супернатанте получали белково-полисахаридный комплекс.
Осадок,  полученный  после  предыдущей стадии,  суспендировали в 0,9 % растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, добавляли детергент твин-80 до конечной концентрации 0,1 %  для улучшения солюбилизации белковых компонентов структур рибосом и  мембран  клеточных элементов.  Суспензию микробных клеток в объеме 30 мл помещали в дезинтегратор УЗДН-2Т и воздействовали ультразвуком в течение 20 мин при частоте 22  и 44 кГц. При ультразвуковой дезинтеграции создается высокий локальный градиент давления, в результате чего клетки разрушаются под действием напряжения сдвига и кавитации (Эльпинер, 1955). Однако следует учитывать, что при жестких режимах ультразвукового воздействия в ультраозвучиваемой  водной среде вследствие возникновения в кавитационных областях электрического напряжения образуются продукты расщепления ионизированных молекул воды – свободные гидроксильные радикалы и атомарный кислород. Эти продукты инициируют деградацию некоторых биологически активных веществ. В связи с этим, необходимо было определить оптимальные условия обработки бакмасс, в частности, частоту и продолжительность воздействия.
Наибольшая активность антигена обнаружена при частоте воздействия 44  кГц в течение 10 мин. По нашему мнению, при меньшей частоте ультразвука происходит недостаточное разрушение микробной клетки и, как следствие, наблюдается меньшая активность антигена. Однако, при жестком ультразвуковом воздействии (более 10 мин) происходит сильное разрушение клетки, вплоть до частичной деградации компонентов, отвечающих за антигенную активность.
Активность антигенных комплексов, выделенных при этой частоте и различной продолжительности ультразвукового воздействия, определяли в РИД. Наибольшая активность антигенов обнаружена при 10-минутном воздействии ультразвуком.
Согласно данным Роуз Э.(1971) с помощью ультразвуковой дезинтеграции выделяются мембранные,  рибосомальные и оболочечные белки.
На заключительном этапе приготовления антигенного комплекса  все полученные  антигенные   фракции  смешивали.
Использование данного метода позволяет получать наиболее полный антигенный комплекс из микробов с сохранением нативности биополимеров, снизить  потери на стадиях выделения. 
Произведено сравнительное изучение иммунохимических характеристик водорастворимых антигенов обоих вариантов (без ультразвука; с ультразвуком) в реакции иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони и в иммуноферментном анализе (ИФА).
Методы получения комплекса антигенов по варианту I (без ультразвука) и по варианту II (с ультразвуком) оценивали по антигенной активности в РИД. Активность антигенов, полученных по методу  с использованием ультразвукового воздействия значительно выше (1:32-1:64). Очевидно, введение ультразвука в технологическую схему получения антигенов приводит к дополнительному освобождению антигенных иммунологически активных детерминант из клетки кампилобактериозного микроба.
Для изучения иммунохимических свойств кампилобактериозных антигенов использовали иммунопероксидазные кампилобактериозные конъюгаты в прямой модификации ИФА. Постановку ИФА осуществляли обычным способомАнтигены, полученные по варианту II, обнаруживаются в реакции в меньших концентрациях, что свидетельствует об их большей иммунологической активности.
Таким образом, подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций (водно-солевая экстракцию с механической и ультразвуковой дезинтеграцией), позволяющий изолировать полноценные белковые антигенные фракции кампилобактериозного микроба в достаточном количестве при сохранении их нативности.

Используемая литература
1.    Афанасьев Е.Н. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella. – Автореф. дисс. ... канд. мед. наук.-Саратов, 1984. - 20 с.
2.    Практическая химия белка. - М.: Мир, 1989. - С. 300-301.
3.    Тюменцева И.С., Жданова Е.В., Афанасьев Е.Н. Усовершенствование производственной схемы иммунизации животных моно- и поликомпонентными антигенами // Актуал. пробл. профилакт. ОО и природно-очаговых инфекц. болезней. - Иркутск, - 1994. - С. 92-93.
4.    Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. - 1977. - Vol. 36. - N 3. - P. 475-483. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody - a new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22. - № 4. - P. 1084-1092.
5.    Polson A., Potgieter G.M., Largier J.E., Mears G.E.F., Joubert F.J. The  fractionation of protein mixtures by linear poolation of IgG from manalion serra with the acid of caprilic // Acch. of Biochem. Stray and Biophys. -  1969. - Vol. 139. - P. 279-284.
6.    Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Garugsterments Enolase // Biochem. J. - 1941. - Vol. 310. - P. 384-421.