Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Кафедра фундаментальных основ клинической медицины
Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.
Актуальность: апоптоз – явление генетически запрограммированной гибели клетки, опосредованной действием специализованных внутриклеточных ферментов – каспаз [1]. Семейство каспаз можно разделить на две группы: эффекторные (каспаза -3, -7) и инициаторные (-2, -9, -8, -10) молекулы. Нарушение активации каспаз является одним из патогенетических механизмов опухолевой трансформации клеток, в частности Т-лимфобластной лейкемии.
В последнее время всё больший интерес в аспекте изучения регуляции апоптоза, вызывает сульфид водорода – внутриклеточный газовый трансмиттер, выполняющий множество физиологических функций [2]. Показано, что сульфид водорода может обладать как про-, так и антиапоптотическим действием в отношении различных типов клеток [3]. Влияние данного газа на программированную гибель опухолевых клеток, а также молекулярные механизмы его действия не изучены.
Цель: оценить роль внутриклеточного газового трансмиттера сульфида водорода в активации каспазы-3 и -9 в клетках линии Jurkat.
Материалы и методы: в работе были использованы клетки линии Jurkat (T-лимфобластная лейкемия) и мононуклеарные лейкоциты, выделенные из крови у 10 здоровых доноров путем центрифугирования на слое фиколла (“Pharmacia” Швеция) плотностью 1,077. В качестве донора сульфида водорода использовали натрий гидросульфид гидрат (NaHS («Sigma», USA)). Количество некротических клеток определяли с помощью световой микроскопии при окраске 0,5% трипановым синим («Serva», США). Для оценки количества клеток с апоптотическими изменениями использовали TUNEL-метод («Webstain», США). Активность каспазы-3 и -9 изучали с помощью спектрофотометрического метода с использованием наборов фирмы («Abcam», США). Полученные данные проверяли на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различия показателей оценивали с применением рангового критерия Манна-Уитни и критерия Краскела-Уоллиса. Различия считались достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты: было показано, что действие NaHS в течение 15 минут на клетки линии Jurkat сопровождалось увеличением числа клеток с апоптотическими признаками до 24,0(21,3-26,4)% при воздействии NaHS концентрацией 10мМ и до 26,0(23,5-28,2)% по сравнению с контролем (16,5 (12,9-17,8)%, р<0,05). Воздействие 50 мМ донора сульфида водорода не приводило к достоверному изменению количества апоптотически-измененных клеток (13 (11,2-17,4)%, р>0,05) по сравнению с контролем. Двухчасовая инкубации клеток линии Jurkat с 10, 50 и 100 мМ донора сульфида водорода не сопровождалась изменениями количества апоптотически-измененных клеток (р>0,05).
Число клеток с некротическими признаками достоверно возрастало до 12,2 (11,1-14,6)% при действии 10 мМ NaHS, до 36 (32,6-39,7)% при 50 мМ и до 52,5 (51,7-56,3)% при действии 100 мМ NaHS в течение 15 минут по сравнению с аналогичным параметром в контроле (7,1 (6,3-7,9)%, p<0,05). Некротическая гибель клеток после 2-х ч инкубации с NaHS увеличивалась до 24 (21,6-25)% при действии 10 мМ, до 53 (49,6-68)% при действии 50 мМ донора сульфида водорода и до 89 (86,4-95,7)% при действии 100 мМ по сравнению с контролем (8 (7,1-9)%, p<0,05). Для изучения влияния сульфида водорода на молекулярные механизмы реализации апоптоза нами использовался NaHS в концентрации 10 мМ.
Апоптотическая гибель мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, не изменялась при действии донора сульфида водорода (р>0,05). Увеличение числа некротических клеток в культуре мононуклеаров здоровых доноров наблюдалось при воздействии NaHS в концентрации 500 мМ (р<0,05).
Активность каспазы-3 и -9 в интактных клетках линии Jurkat была принята за 1 усл. ед. При 15 мин воздействии на данные клетки 10 мМ NaHS было зафиксировано увеличение активности каспазы-3 до 1,6 усл. ед. и активности каспазы-9 до 2,7 усл. ед. (р<0,05). Активность касапазы-3 составила 0,45 усл. ед., каспазы-9 – 1,7 усл. ед. (р<0,05) при воздействии на клетки линии Jurkat 10 мМ NaHS в течение 2 часов. В мононуклеарных лейкоцитах здоровых доноров активность каспазы-3 составила 0,72 (р<0,05) и каспазы-9 – 1,4 усл. ед. (p>0,05).
Выводы: результаты настоящей работы показали, что донор сульфида водорода в концентрации 10мМ и 100мМ обладает проапоптотическим эффектом в отношении клеток линии Jurkat, проявляющимся после 15 мин инкубации. Сульфид водорода не оказывает влияние на апоптоз мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров. Проапоптотическое действие сульфида водорода связано с активацией каспазы-3 и -9.
Список литературы:
1. Молекулярная биология / Н. Н. Мушкамбаров, С. Л. Кузнецов. – М. : Медицинское информационное агентство, 2007. – 444 с.
2. Hydrogen sulfide (H2S) – the third gas of interest for pharmacologists / E. Lowicka, J. Beltowski // Pharmacological Reports. – 2007. - № 59. – P. 4-24.
3. Hydrogen sulfide-induced apoptosis of human aorta smooth muscle cells via the activation of mitogen-activated protein kinases and caspase-3 / G. Yang, X. Sun, R. Wang // FASEB J. – 2004. - № 18. – P. 1782-1784.
|
