|
СГМУ, г.Томск
Эта работа опубликована в сборнике "НАУКИ О ЧЕЛОВЕКЕ" – Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск. - СГМУ. – 2003. – 268 с.
Скачать сборник целиком
За последние десятилетия изучение носителей генетической информации: ДНК и РНК значительно расширило область знаний исследователей интересующихся данной проблемой. К числу особо важных для молекулярно-биотехнологических методов, а также методов очень чувствительных для диагностики различных инфекционных заболеваний, относится полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод обладает высокой чувствительностью, высокой специфичностью и позволяет установить присутствие нескольких единичных молекул ДНК или РНК микроорганизма в анализируемом биологическом образце. В качестве матрицы для ПЦР используют высокоочищенную ДНК и РНК. В связи с этим первоочередной задачей исследователя применяющего ПЦР, является выбор метода для выделения ДНК и РНК, который позволит получить максимальное количество высокоочищенного продукта. Особенно осторожно следует подходить к выбору метода выделения РНК, поскольку РНК по сравнению с ДНК более лабильна и чувствительна к действию нуклеаз, кроме того РНК-азы менее чувствительны к действию денатурирующих веществ используемых в наборах.
Целью настоящей работы явилось проведение сравнительного анализа выделения РНК различными методами.
Материалом исследования служила периферическая кровь (с 5%ЭДТА и без ЭДТА). Для проведения сравнительного анализа эффективности выделения РНК использовались наборы: «Рибозоль» (ЦНИИ эпидемиологии г. Москва), TRIZOL™ (GibcoBRL, Life Technologies), набор для выделения РНК на сорбенте (Медиген, г Новосибирск), также для выделения РНК применяли сорбционный метод с использованием диатомового сорбента и метод щелочного лизиса с 0.1%
SDS.
После выделения РНК проводили качественный (электрофорез а агарозном геле) и количественный анализ полученных результатов. Концентрацию нуклеиновых кислот измеряли на спектрофотометре СФ-56, при 260, 280, 320 нм. На основе полученных данных проводили расчет концентрации РНК в анализируемых образцах, исходя из того, что одна единица оптической плотности примерно соответствует 40мкг/мл одноцепочечной ДНК или РНК. Для оценки чистоты образцов использовали отношение между оптической плотностью при 260 и 280 нм. Для чистых препаратов оно должно быть равно 1,8-2.
Результаты, полученные в ходе работы, представлены в таблице.
| Метод |
Забор крови |
СРНК нг/мкл |
260/280 |
| TRIZOL™ |
С ЭДТА |
32±1.2 |
1,9 |
| Без ЭДТА |
24.1±4.7 |
2,25 |
| Щелочной лизис |
С ЭДТА |
39±7.1 |
2,9 |
| Без ЭДТА |
13±2 |
2,4 |
| «Рибозоль» |
С ЭДТА |
380±64.4 |
2,2 |
| Без ЭДТА |
190±18.7 |
2,3 |
| Диатомовый
сорбент |
С ЭДТА |
47.6±18.3 |
1,2 |
| Без ЭДТА |
51±7.6 |
1,3 |
| «Медиген» |
С ЭДТА |
76±9.3 |
2,1 |
| Без ЭДТА |
83.2±15.5 |
1,9 |
В результате проделанной работы установлено, что набор для выделения РНК
«Рибозоль», позволяет получить максимальное количество РНК. Набор, основанный на сорбции РНК на диатомовом сорбенте, показал низкий выход и низкую чистоту конечного продукта, что неприемлемо для успешного проведения ПЦР. Наиболее адекватным набором для проведения РТ-ПЦР, по показателям количества и чистоты, является тризоловый метод TRIZOL™ (GibcoBRL, Life Technologies).
Литература:
1. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под редакцией С. Херрингтона и Дж. Макги. - Мир., 1999. - 535с.
2. Chang S., Puryear J., Cairney J. (1993) A Simple and Efficient Method for Isolating RNA from Pine Trees. Plant Molecular Biology Reporter 11: 113-116.
3. MUD-DNA Extraction Protocol. Departament of Biological Sciences University of South Carolina Columbia.
|
