ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России» (г. Томск)
НОЦ молекулярной медицины, кафедра фундаментальных основ клинической медицины, кафедра патофизиологии

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.

 

В настоящее время актуальным направлением медицины является исследование модуляции апоптоза как важного патогенетического звена многочисленных заболеваний. Согласно современным представлениям, формирование злокачественных опухолей также имеет в своей основе нарушение программированной гибели клетки [1, 2]. Реализация танатогенной программы зависит от наличия или активации многочисленных факторов и процессов, модулирующих программированную клеточную гибель. К ним можно отнести как постоянно существующие в клетке белки, такие как семейство Bcl-2 и IAP, так и индуцируемые стрессом молекулы, к числу которых относятся белки теплового шока (Heat shock proteins - Hsp) [3]. В последнее время именно белкам теплового шока отводят существенную роль в дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток, в которых данные белки экспрессируются в изобилии. Было показано, что оверэкспрессия Hsp90 коррелирует с плохим прогнозом острой миелоидной лейкемии и миелоидными дисплазийными синдромами [2, 4]. Наряду с этим остаётся нерешённым вопрос о молекулярных механизмах участия вышеуказанного шаперона в дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток. В связи с этим, целью работы явилась оценка роли белка теплового шока 90 в апоптозе опухолевых клеток линии Jurkat.

Материал и методы.
Материалом для исследования служили опухолевые клетки линии Jurkat (Т-лимфобластный лейкоз человека), полученные из банка клеточных культур НИИ цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Клетки культивировали в чашках Петри  при 37*С и 5% СО2 в питательной среде, содержащей 90% RPMI-1640, L-глутамин (0,3 мкг/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Gibco», США), инактивированной при 560С в течение 30 мин. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры каждые 2-3-е суток; жизнеспособность клеток оценивали с помощью трипанового синего.
В качестве индуктора апоптоза опухолевых клеток применяли rTNFα человека («Abcam», Великобритания) в концентрации 1, 5, 10 и 30 нг/мл. Для выявления роли белка теплового шока 90 (Hsp90) в регуляции программированной гибели клеток в культуру добавляли селективный ингибитор Hsp90 17-AAG («Sigma Aldrich», США) в концентрации 5 мкМ/мл и инкубировали в течение 18 ч при температуре 37º С и 5% СО2 в присутствии rTNFα и без него.
Оценку реализации апоптоза проводили методом флуоресцентной микроскопии на микроскопе Axiostar plus («Carl Zeiss», Германия) с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидий иодида («Catlag», США) согласно инструкции фирмы-производителя.
Изменения трансмембранного потенциала митохондрий определяли методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора «MitoScreen» («BD Pharmigen», США).
Активность каспазы-8 и -3 определяли с помощью спектрофотометрического метода согласно инструкции фирмы-производителя («Abcam», Великобритания).
Полученные данные обрабатывали методами статистического анализа с помощью программы SPSS 13,0. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Шапиро-Вилка. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (для выборок, подчиняющихся ненормальному закону распределения) и двухвыборочного критерия Стьюдента (для выборок, подчиняющихся нормальному закону распределения) . Данные представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q1-Q3). Статистически значимыми различия считались при р<0,05.

 

Результаты
При добавлении в культуральную среду rTNFα и ингибитора 17-AAG отмечалось наиболее значимое увеличение числа апоптотически измененных клеток линии Jurkat по сравнению с интактной культурой (р<0,01) (рис.1). Было установлено, что ингибитор Hsp90 повышает активность каспазы 8 в опухолевых клетках линии Jurkat относительно аналогичного показателя в интактной культуре  до (1,00 (0,98 - 1,30) усл.ед.,  и 0,53(0,46 - 0,58) усл.ед., соответственно). При этом эффект 17-AAG на данную каспазу не отличался от эффекта r-TNFα (0,85 (0,76 - 0,94) усл.ед.). Нами высказано предположение, что Hsp90 регулирует  рецепторный путь реализации апоптоза не только через RIP, Akt, NF-κB [10], но и напрямую, ингибируя превращение прокаспазы 8 в активную форму. Оценка активности каспазы 3 в опухолевых клетках линии Jurkat показала, что при ингибировании Hsp90 активность каспазы-3 увеличивается в 5 раз (р=0,04)  по сравнению с интактной культурой.
Оценка содержания клеток с деполяризованной митохондриальной мембраной в культурах линии Jurkat при добавлении ингибитора 17-AAG и совместного его действия с r-TNFα показала увеличение данного параметра  в 1,7 раза по сравнению с интактными клетками  (p=0,02). Полученные результаты свидетельствуют о влиянии Hsp90 на целостность мембраны митохондрий.
Таким образом, белок теплового шока 90 играет антиапоптотическую роль в клетках линии Jurkar. Угнетение активности данного белка приводит к активации каспазы-8 и -3 , снижению трансмембранного потенциала митохондрий и, как следствие, запуску  апоптотической программы опухолевых клеток. 17-AAG потенцирует rTNFα -индуцированный апоптоз. Применение селективного ингибитора 17-AAG в качестве индуктора апоптоза опухолевых клеток открывает новые возможности в существующих подходах к лекарственному лечению злокачественных новообразований.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы (ГК № П1203; ГК 02.740.11.0311), поддержана грантами Carl Zeiss и Совета по грантам при Президенте РФ (МК-480.2011.7).