Авторы: Собенин И.А. ^1,2,3, Сазонова М.А. ^1,2,3, Мясоедова В.А. ^1,2, Кириченко Т.В. ^1,2, Иванова М.М. ^1,2, Постнов А.Ю ³, Орехов А.Н. ^1,2

¹ Научно-исследовательский институт атеросклероза РАЕН;

² Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН;

³Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗиСР, г. Москва.

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.

Резюме

В клиническом исследовании изучена связь уровня гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т гена MT-TL1 с предрасположенностью к развитию каротидного атеросклероза, наличием атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий, наличием ишемической болезни сердца, инфарктом миокарда в анамнезе. Выявлена высокая сопряженность этих показателей. Впервые установлено, что высокая степень гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т является независимым генетическим фактором риска и маркером предрасположенности к атеросклерозу и его клиническим проявлениям.

Введение

Атеросклероз, наиболее распространенная в современном обществе патология, является мультифакторным заболеванием, в развитии и прогрессировании которого играет значительную роль взаимодействие фенотипических, средовых, социально-экономических и генетических факторов. При этом известные генетические факторы риска, включающие многочисленные полиморфизмы ядерного генома, в состоянии объяснить не более 3% вариабельности клинических проявлений атеросклероза, в частности, ишемической болезни сердца (ИБС). Долгое время вне внимания оставались мутации митохондриального генома, которые могут быть как соматическими, так и наследуемыми по материнской линии. Подобные мутации могут играть патогенетическую роль в формировании атеросклеротических поражений магистральных артерий человека, поскольку способны вызывать различные дефекты в белковых цепях некоторых дыхательных ферментов и транспортных РНК (тРНК), синтезирующихся непосредственно в митохондриях. Это приводит к уменьшению концентрации данных ферментов и тРНК или полной их дисфункции, что способствует развитию окислительного стресса и повышенной вероятности возникновения и развития атеросклероза.

Для полиморфизмов митохондриального генома характерно явление гетероплазмии, при котором в митохондриях клетки одновременно присутствует множество копий ДНК, несущих нормальный или мутантный аллель, а их соотношение варьирует в широких пределах; при этом различные ткани организма или даже соседние участки одной и той же ткани могут различаться по степени гетероплазмии. Недавно мы установили, что имеются существенные различия в степени гетероплазмии по точечной замене 3256С/Т в нуклеотидной последовательности гена MT-TL1 митохондриальной ДНК, кодирующего тРНК лейцина, между тканью непораженной интимы аорты человека и тканью липофиброзной атеросклеротической бляшки [1].

Учитывая ту патогенетическую роль, которую играют моноциты крови человека в формировании атеросклеротических поражений [2], мы сочли целесообразным исследовать связь между мутационной нагрузкой клеток периферической крови и предрасположенностью к атеросклерозу.

В данном исследовании мы изучили ассоциацию между степенью гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т в лейкоцитах крови и атеросклеротическими поражениями каротидного бассейна, а также ИБС – основным клиническим проявлением атеросклероза.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 191 человек (84 мужчины, 107 женщин) в возрасте 65,0 лет (SD=9,4); из них 45 участников (23,6%) имели ИБС. По соотношению полов условно здоровые лица и больные ИБС достоверно не различались (60:86 и 24:21 для мужчин и женщин, соответственно, p=0,17). Больные ИБС были старше условно здоровых лиц (средний возраст составил 70,0 (SD=8,7) и 63,5 (SD=9,0), соответственно, p<0,001).

Обследование заключалось в оценке состояния артерий бассейна сонных артерий с помощью ультразвукового сканирования в режиме высокого разрешения [3], а также в измерении степени гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т в лейкоцитах крови [1].

При ультразвуковом сканировании сонных артерий оценивали наличие атеросклеротических бляшек по 4-бальной системе (0 — отсутствие возвышенных атеросклеротических поражений, 1-2 — стабильные атеросклеротические бляшки со стенозом просвета сосуда до 20% и от 20 до 50%, соответственно, 3 — гемодинамически значимые атеросклеротические бляшки со стенозированием более 50%). Также измеряли толщину комплекса интима-медия общей сонной артерии на дистальном отрезке протяженностью 1 см в трех проекциях. Исследование проводили на аппарате SSI-1000 (Sonoscape, Китай). Анализ толщины комплекса интима-медия проводили с использованием специализированного программного пакета M’Ath (IMT, Франция).

Степень предрасположенности к атеросклерозу оценивали по толщине комплекса интима-медия, используя нормативные показатели, разработанные для московской популяции [4]. Принадлежность к 1-й квартили распределения показателя в популяции расценивали как низкую предрасположенность к атеросклерозу, ко 2-й квартили – как умеренную, к 3-ей квартили – как повышенную, к 4-й квартили – как высокую.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного пакета SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Применяли методы однофакторного вариационного анализа, кросс-табуляционного анализа, корреляционного анализа по Spearman и Pearson. Сравнение средних значений для непрерывных переменных проводили с использованием U-теста по Mann-Whitney, для категорийных величин – с использованием показателя хи-квадрат по Pearson [5]. Различия считали достоверными при вероятности безошибочного прогноза более 95%.

Результаты

Средний уровень гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т в лейкоцитах крови составил 23,3% (SD=14,7), при этом распределение данного показателя и обследованной выборке существенно отличалось от нормального (тест Колмогорова-Смирнова с поправкой по Lilliefors, p<0,001). Степень гетероплазмии варьировала в пределах от 5% до 74%, то есть наличие мутантного аллеля было выявлено у всех участников исследования. Медиана составила 18%, межквартильный размах – от 13% (25-я процентиль) до 36% (75-я процентиль).

Было выявлено различие в степени гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т между мужчинами и женщинами; показатели составили 20,8% (SD=15,1) и 25,4 (SD=14,1), соответственно (p=0,001).

Была оценена связь уровня гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т и предрасположенностью к атеросклерозу. У лиц с низкой предрасположенностью к атеросклерозу средний уровень гетероплазмии составил 16,8% (SD=11,3), с умеренной предрасположенностью – 23,8% (SD=14,3), с повышенной предрасположенностью – 25,2% (SD=15,9), и у лиц с высокой предрасположенностью – 28,3% (SD=14,8). Однофакторный вариационный анализ выявил линейную взаимосвязь между толщиной интимо-медиального комплекса общих сонных артерий и уровнем гетероплазмии 3256С/Т (F=5,674; p=0,001); коэффициент корреляции между этими показателями составил 0,295 (p<0,001). Площадь под характеристической операторской кривой в условиях, когда положительным реальным значением являлась высокая предрасположенность к развитию атеросклероза, составила 0,625 (95% доверительный интервал 0,528-0,722, p=0,012). Анализ соотношения чувствительности и специфичности позволил определить пороговое значение уровня гетероплазмии для диагностики высокой предрасположенности к развитию атеросклероза, которое составило 19,5%. При этом чувствительность диагностики составила 63,6%, а специфичность – 63,3%.

Была оценена связь уровня гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т и выраженностью атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий. Эти показатели также оказались взаимосвязанными (p<0,001); коэффициент корреляции составил 0,333 (p<0,001). Данные о средних значениях показателей гетероплазмии 3256С/Т в зависимости от степени развития атеросклеротических бляшек представлены на рисунке 1. Площадь под характеристической операторской кривой в условиях, когда в качестве положительного реального значения было использовано наличие атеросклеротической бляшки любой степени выраженности, составила 0,675 (95% доверительный интервал 0,596-0,753, p<0,001). Анализ соотношения чувствительности и специфичности позволил определить пороговое значение уровня гетероплазмии для диагностики наличия атеросклеротической бляшки, которое составило 17,5%. При этом чувствительность диагностики составила 60,7%, а специфичность – 63,1%.

Была оценена связь уровня гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т и наличием клинических проявлений атеросклероза. Средний уровень гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т в лейкоцитах крови условно здоровых лиц составил 21,7% (SD=13,4), а у больных ИБС – 28,8% (SD=17,3), различия были достоверными при p=0,035. Площадь под характеристической операторской кривой составила 0,604 (95% доверительный интервал 0,500-0,707, p=0,036), положительным реальным значением было наличие ИБС. Пороговое значение уровня гетероплазмии для диагностики ИБС было равным 19,5%, при этом чувствительность диагностики составила 60,0%, а специфичность – 62,3%.

У лиц, перенесших инфаркт миокарда (n=7), был отмечен повышенный уровень гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т по сравнению с лицами, не имевшими инфаркта миокарда в анамнезе (n=184). Показатели составили 38,4% (SD=20,7) и 22,8% (SD=14,1), соответственно, p=0,042. При этом у больных ИБС, не имевших перенесенного инфаркта миокарда в анамнезе, уровень гетероплазмии 3256С/Т составил 27,0% (SD=16,3), то есть являлся промежуточным значением (однофакторный вариационный анализ: F=6,142; p=0,003).

При анализе соотношения чувствительности и специфичности показателя гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т в отношении инфаркта миокарда оказалось, что площадь под характеристической операторской кривой составила 0,726 (95% доверительный интервал 0,510-0,943, p=0,042), положительным реальным значением было наличие инфаркта миокарда в анамнезе. Пороговым значением являлся уровень гетероплазмии 22,5%. Из-за малого количества участников выборки, имевших инфаркт миокарда в анамнезе, расчетные показатели чувствительности и специфичности диагностики были признаны ненадежными.

Поскольку распределение показателя гетероплазмии 3256С/Т в обследованной группе лиц резко отличалось от нормального, то был проведен двухступенчатый кластерный анализ. Оказалось, что существует, по меньшей мере, два различных распределения степени гетероплазмии по полиморфизму 3256С/Т в лейкоцитах крови в обследованной выборке, со средними значениями гетероплазмии 15,1% (SD=4,9; n=138) и 44,9% (SD=8,2; n=53). В заключительном кросс-табуляционном анализе принадлежность участника исследования к кластеру 1 или 2 использовали как классификационную (номинальную) переменную. Результаты представлены в таблице 1.

Было установлено, что у лиц с высоким уровнем гетероплазмии 3256С/Т (кластер 2), относительный риск наличия атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий равен 2,46 (95% доверительный интервал – от 2,07 до 2,55), относительный риск ИБС – 2,28 (95% доверительный интервал – от 1,32 до 3,82), а относительный риск инфаркта миокарда – 6,51 (95% доверительный интервал – от 1,16 до 47,98). Точность диагностики составила 70,7%, 70,7% и 73,8%, соответственно.  

Таблица 1. Сопряженность фенотипических и клинических проявлений атеросклероза с показателями гетероплазмии 3256С/Т.

Уровень гетероплазмии 3256С/Т коррелировал с возрастом участников исследования (r=0,296; p<0,001), что говорит о возможности накопления мутантного аллеля в течение жизни индивидуума. Данная корреляция наблюдалась как у мужчин (r=0,312; p=0,004), так и у женщин (r=0,259; p=0,007).

Корреляция уровня гетероплазмии 3256С/Т с традиционными факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний была выявлена только у женщин для показателей систолического артериального давления (r=0,307; p=0,001) и триглицеридов сыворотки крови (0,242; p=0,012).

Обсуждение

Результаты данного исследования показали, что полиморфизм 3256С/Т митохондриальной ДНК лейкоцитов крови человека определенно ассоциирован с атеросклерозом, причем эта сопряженность имеет высокую степень достоверности. Примечательно, что сопряженность имеется не только с количественными ультрасонографическими характеристиками предрасположенности к атеросклерозу (толщиной интимо-медиального слоя общих сонных артерий), с ультрасонографическими признаками субклинического атеросклероза (наличием атеросклеротических бляшек и степенью их выраженности), но и с клиническими проявлениями атеросклероза (ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда).

Таким образом, степень гетероплазмии 3256С/Т митохондриального генома лейкоцитов крови человека является фактором риска атеросклероза и может быть использована в качестве информативного маркера генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда. Относительный риск, определяемый с помощью данного маркера, существенно превосходит диагностические характеристики известных фенотипических факторов риска, которые обычно варьируют в пределах 1,4-1,8.

Анализ результатов нашего исследования позволил определить пороговое значение уровня гетероплазмии 3256C/T в отношении риска атеросклероза и его клинических проявлений. Все использованные подходы к оценке чувствительности и специфичности (использование в качестве положительного реального значения высокой предрасположенности к атеросклерозу, наличия атеросклеротических бляшек, наличия ИБС или инфаркта миокарда в анамнезе) дали близкие оценки порогового уровня гетероплазмии, которые в среднем составили 20%.

Полиморфизм 3256С/Т описан в литературе, как мутация митохондриального генома, ассоциированная с развитием MELAS-синдрома, одного из нейродегенеративных митохондриальных заболеваний. При этом заболевании отмечаются митохондриальная миопатия, энцефалопатия, молочнокислый ацидоз; также могут отмечаться инсультоподобные состояния [6, 7]. Описана сопряженность данной мутации с сахарным диабетом 2 типа митохондриального генеза [8].

Тем не менее, ассоциация полиморфизма 3256C/T с атеросклерозом до сих пор не была продемонстрирована. Возможно, это связано с методологическими проблемами: подавляющее большинство методов анализа последовательности нуклеотидов не позволяют проводить точное количественное измерение, а свидетельствуют лишь о наличии мутантного аллеля или дают поликоличественную оценку доли мутантного аллеля в биологических образцах [9-11]. В то же время для полиморфизма 3256C/T не описано явления гомоплазмии [12], то есть мутантный аллель будет присутствовать во всех исследуемых образцах, что характерно для гетероплазмии и затрудняет анализ связи данного полиморфизма с каким-либо заболеванием человека. Результаты нашего исследования также показали, что гетероплазмия 3256C/T имеется у 100% участников.

Способ диагностики, связанный с количественным определением кодируемого продукта и/или метаболитов также имеет существенные ограничения, поскольку позволяет предполагать только наличие большей или меньшей экспрессии мутантного аллеля [13].

Разработанный нами ранее способ количественного определения доли мутантного аллеля (степени гетероплазмии) обладает достаточной точностью и воспроизводимостью, поскольку основан на пиросиквенировании ампликонов участков ДНК, содержащих полиморфный сайт. Расчет доли мутантного аллеля производится путем сопоставления пиков флюоресценции нуклеотидов, определяемых в заданной позиции олигонуклеотидной последовательности [1]. Использование такого методологического подхода позволило оценить вариабельность уровня гетероплазмии 3256C/T в обследованной выборке, а также изучить ассоциацию этого генетического маркера с предрасположенностью к атеросклерозу, также охарактеризованною количественными методами.

Полиморфизм 3256C/T локализуется в гене MT-TL1 (кодон узнавания UUR) митохондриального генома человека, кодирующем последовательность тРНК лейцина.  Проявлением данной мутации на клеточном уровне является сниженное количество органелл и нарушение синтеза белка [14-16]. Очевидно, что клинические и фенотипические проявления будут зависеть от уровня гетероплазмии.

Широкая распространенность полиморфизма 3256C/T позволяет предполагать, что это наследуемая мутация. Тем не менее, выявленная корреляция уровня гетероплазмии 3256C/T с возрастом не позволяет исключить соматическую природу мутации; во всяком случае, с возрастом происходит увеличение доли мутантного аллеля в митохондриальном геноме клеток крови человека. При этом неизвестно, происходят ли процессы накопления мутантного аллеля в других тканях организма человека. Не исключено также преимущественное выживание соматических клеток или клеток-предшественников, имеющих повышенное содержание мутантного аллеля в митохондриальной ДНК, хотя это предположение и противоречит факту ассоциации мутации 3256C/T с нейродегенеративными заболеваниями и атеросклерозом.

Клетки крови, в особенности моноциты-макрофаги, играют важную роль в атерогенезе. Мигрируя в субэндотелиальное пространство артерий эластического и мышечно-эластического типа, они активно участвуют в процессах воспаления и формирования атеросклеротических поражений. Можно предположить, что чем выше уровень гетероплазмии митохондриальной ДНК, тем выше вероятность ингибирования функциональной активности моноцитов. Если мутация наблюдаются в кодирующей области гена, как в случае 3256C/T, то это может привести к локальной патологической реакции, способствующей развитию атеросклероза.

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что гетероплазмия по полиморфизму 3256C/T митохондриальной ДНК лейкоцитов крови является биомаркером митохондриальной дисфункции, а также биомаркером генетической предрасположенности к развитию атеросклероза и связанных с ним  миокарда.   Тем не менее, данное исследование имеет свои ограничения. Размер выборки был достаточным для выявления достоверных различий в уровне гетероплазмии 3256C/T между условно здоровыми лицами и больными ИБС (статистическая мощность составила 81,2% при условии α<0,05), но недостаточным для исключения ошибки 2 типа при анализе различий между лицами, перенесшими инфаркт миокарда и лицами, не имеющими инфаркт в анамнезе (статистическая мощность составила только 63,0% при условии α<0,05). Следует также учесть, что данная выборка была сформирована в генетически неоднородной московской популяции лиц старшего и пожилого возраста. Поэтому  в настоящее время нет достаточных оснований для интерполяции полученных результатов на другие популяции и возрастные группы. Наконец, данное исследование было кросс-секционным, поэтому оценка реальных прогностических рисков атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний, обусловленных наличием высокой степени гетероплазмии по полиморфизму 3256C/T требует проведения проспективных исследований.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.

Литература

1.             Sazonova M.A., Budnikov E.Yu., Khasanova Z.B., Sobenin I.A., Postnov A.Yu., Orekhov A.N. Studies of the human aortic intima by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome. // Atherosclerosis.-2009.-Vol.204.-pp.184-190.

2.             Bobryshev Y.V. Monocyte recruitment and foam cell formation in atherosclerosis. // Micron.-2006.-Vol.37.-pp.208-222.

3.             Salonen R., Nyyssonen K., Porkkala E.,  Rummukainen J., Belder R., Park J.S., Salonen J.T. Kuopio Atherosclerosis Prevention Study (KAPS). A population-based primary preventive trial of the effect of LDL lowering on atherosclerotic progression in carotid and femoral arteries. // Circulation.-1995.-Vol.92.-pp.1758-1764.

4.             Собенин И.А., Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Чупракова О.В., Кожевникова Ю.А., Ковалевская Л.О., Орехов А.Н., Балдассарре Д., Тремоли Е. Возможная роль экологических факторов в формировании предрасположенности к развитию атеросклероза в московской популяции. // Бюллетень московского общества испытателей природы, отдел биологический.-2009.-Т.114.-стр. 302-315.

5.             Lang T.A., Secic M. How to report statistics in medicine: annotated guidelines for authors, editors, and reviewers. Second edition. American College of Physicians, Philadelphia, 2006, 490 P.

6.             Sato W., Hayasaka K., Shoji Y., Takahashi T., Takada G., Saito M., Fukawa O., Wachi E. A mitochondrial tRNA(Leu)(UUR) mutation at 3256 associated with mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS). // Biochemistry and Molecular Biology International (Sydney).-1994.-Vol.33.-pp.1055-1061.

7.             Jeppesen T.D., Schwartz M., Hansen K., Danielsen E.R., Wibrand F., Vissing J. Late onset of stroke-like episode associated with a 3256CàT point mutation of mitochondrial DNA. // Journal of the Neurological Sciences.-2003.-Vol.214.-pp.17-20.

8.             Gerbitz K.D., van den Ouweland J.M., Maassen J.A., Jaksch M. Mitochondrial diabetes mellitus: a review. // Biochimica et Biophysica Acta.-1995.-Vol.1271.-pp. 253-260.

9.             Cassandrini D., Calevo M.G., Tessa A., Manfredi G., Fattori F., Meschini M.C., Carrozzo R., Tonoli E., Pedemonte M., Minetti C., Zara F., Santorelli F.M., Bruno C. A new method for analysis of mitochondrial DNA point mutations and assess levels of heteroplasmy. // Biochemical and Biophysical Research Communications.-2006.-Vol.342.-pp.387-393.

10.         Lim K.S., Naviaux R.K., Wong S., Haas R.H. Pitfalls in the denaturing high-performance liquid chromatography analysis of mitochondrial DNA mutation. // Journal of Molecular Diagnostics.-2008.-Vol.10.-pp.102-108.

11.         Nishigaki Y., Ueno H., Coku J., Koga Y., Fujii T., Sahashi K., Nakano K., Yoneda M., Nonaka M., Tang L., Liou C.W., Paquis-Flucklinger V., Harigaya Y., Ibi T., Goto Y., Hosoya H., DiMauro S., Hirano M., Tanaka M. Extensive screening system using suspension array technology to detect mitochondrial DNA point mutations. // Mitochondrion.-2010.-Vol.10.-pp.300-308.

12.         www.mitomap.org/bin/view.pl/Main/SearchAllele.

13.         Wibrand F., Jeppesen T.D., Frederiksen A.L., Olsen D.B., Duno M., Schwartz M., Vissing J. Limited diagnostic value of enzyme analysis in patients with mitochondrial tRNA mutations. // Muscle and Nerve.-2010.-Vol.41.-pp.607-613.

14.         Moraes C.T., Ciacci F., Bonilla E., Jansen C., Hirano M., Rao N., Lovelace R.E., Rowland L.P., Schon E.A., DiMauro S. Two novel pathogenic mitochondrial DNA mutations affecting organelle number and protein synthesis. Is the tRNALeu(UUR) gene an etiologic hot spot? // Journal of Clinical Investigation.-1993.-Vol.92.-pp.2906-2915.

15.         Rossmanith W., Karwan R.M. Impairment of tRNA processing by point mutations in mitochondrial tRNA(Leu)(UUR) associated with mitochondrial diseases. // FEBS Letters.-1998.-Vol.433.-pp.269-274.

16.         Levinger L., Morl M., Florentz C. Mitochondrial tRNA 3' end metabolism and human disease. // Nucleic Acids Research.-2004.-Vol.32.-pp.5430-5441.