Авторы:

Мухамедова Н. М., Свиридов Д. Д., Карагодин В. П., Мельниченко А. А., Мясоедова В. А., Орехова В. А., Собенин И. А., Орехов А. Н.

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН (г. Москва)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.

РЕЗЮМЕ

Восемь белков, потенциально вовлеченных в отток холестерина (ABCA1, ABCG1, CYP27A1, phospholipid transfer protein (PLTP), SR-B1, caveolin-1, cholesteryl ester transfer protein (CETP) и аполипопротеин A-I (apoA-I)), были оверэкспрессированы каждый по отдельности или в комбинации в макрофагах RAW 264.7. При использовании в качестве акцептора apoA-I оверэкспрессия комбинации ABCA1, CYP27A1, PLTP и SR-B1 (комбинация I) повышала отток в 4,3 раза. Было установлено, что стимуляция оттока обусловлена избытком ABCA1 и повышенным связыванием apoA-I с сайтами на макрофагах, не имеющих отношения к АВСА1. Эта комбинация вызывала лишь небольшое увеличение оттока к выделенным липопротеидам высокой плотности (ЛВП). Когда в качестве акцептора были использованы ЛВП, оверэкспрессия caveolin-1 или комбинации caveolin-1 с SR-B1 (комбинация II) были наиболее активными, увеличивая отток к ЛВП без влияния на отток к apoA-I. При оценке оттока холестерина на мышиной модели in vivo, оверэкспрессия АВСА1 и комбинации I повышали экспорт холестерина из макрофагов в плазму, печень и кал, тогда как оверэкспрессия caveolin-1 или комбинации II не вызывали какой-либо эффекта. Можно заключить, что путь оттока холестерина, использующий  apoA-I в качестве акцептора, имеет доминирующий вклад в экспорт холестерина из макрофагов in vivo.

ВВЕДЕНИЕ

Отток холестерина является первой и, скорее всего, лимитирующей стадией обратного транспорта холестерина (ОТХ). ОТХ - это путь удаления избытка холестерина из внепеченочных клеток, особенно важно, из сосудистых клеток, что обеспечивает защиту сосудистой стенки от развития атеросклероза. Было описано несколько путей оттока холестерина. Одним из них является диффузионный путь, который не зависит от какого-либо специального клеточного белка. Несколько специфичных путей включают большое число клеточных белков. Во-первых, это ABC транспортеры, такие как ABCA1 [1] и ABCG1 [2], опосредующие отток холестерина на обезлипиженный апоА-I и на зрелые ЛВП, соответственно. SR-B1, другой клеточный белок, участвует в оттоке холестерина, для которого ЛВП являются акцептором [3]. Недавно было показано, что CYP27A1 [4] и caveolin-1 [5] также участвуют в оттоке холестерина. Ряд других белков, как было продемонстрировано, также вносят свой вклад в отток холестерина, в том числе внутриклеточный аполипопротеин AI (апоА-I) [6], белок переноса фосфолипидов (PLTP) [7] и белок-переносчик эфиров холестерина (CETP) [8]; механизмы их участия в оттоке холестерина в основном неизвестны.

         Неизвестно также, каким образом различные пути и их компоненты взаимодействуют друг с другом, являются ли они синергетическими, конкурирующими или избыточными и каков относительный вклад каждого пути в суммарном экспорте холестерина из клеток. Было высказано предположение, что ABCA1 и ABCG1 работают как последовательно, так и синергично, приводя к образованию обогащенных холестерином ЛВП [9-11], а SR-B1 конкурирует с ABCA1 и ABCG1 за холестерин, предназначенный для оттока [12, 13]; взаимодействия между другими компонентами пути оттока холестерина не были исследованы. В большинстве исследований были использованы легко трансфецируемые клеточные линии, однако неясно, могут ли полученные на них данные точно описать пути оттока холестерина из клеток сосудистой стенки, прежде всего, из макрофагов. Существуют значительные различия в путях оттока холестерина и их регуляции в различных клетках и тканях [14]. Различные пути оттока используют различные акцепторы холестерина и вклад этих акцепторов, следовательно, и клеточных белков, взаимодействующих с этими акцепторами, в общий экспорт холестерина остается неясным. Большинство апоА-I в плазме присутствует в липидированной форме, в то же время инактивация ABCA1, который использует обезлипиженный апоА-I в качестве акцептора, приводит к развитию тяжелых форм атеросклероза [15, 16], с другой стороны, инактивация ABCG1, который использует липидированный апоА-I, имеет небольшое и противоречивое влияние на атеросклероз [17-19].       В данной работе мы воспользовались новым методом высокоэффективной трансфекции макрофагов [20] для избирательного усиления различных путей оттока холестерина, чтобы исследовать вклад путей, использующих апоА-I, в сопоставлении с теми, которые используют в качестве акцептора ЛВП, в суммарном экспорте холестерина из макрофагов in vitro и in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки и плазмиды.          Клетки мышиных макрофагов RAW 264.7 содержались в культуре и были трансфицированы как описано ранее [20]. THP-1 клетки культивировали в RPMI с добавлением 10% FBS. Клетки были дифференцированы в макрофаг-подобные клеток при инкубации в RPMI с добавлением 10% FBS, 100 нмоль/л форболового 12-миристат-13-ацетата (PMA) и 100 нмоль/л витамина D3 в течение 48 ч. Дифференцированные клетки трансфицировали с использованием Metafectene (Biontex, Мюнхен, Германия) по протоколу производителя и культивировали в RPMI с добавлением 10% FBS, 100 нмоль/л PMA, 100 нмоль/л витамина D3, и 1 мкмоль/л 5-азацитидина. Плазмиды, содержащие ABCA1 и ABCG1-GFP человека, а также плазмиды, содержащее ABCG1-myc, SR-B1 мыши, PLTP человека были получены из лаборатории приглашенного руководителя проекта. Гены апоА-I, caveolin-1 и CYP27A1 человека были описаны ранее [4, 5, 21]. Все гены были клонированы в pcDNA3.1 плазмиду. Плазмида pCMV-β-Gal была использована для ложной трансфекции и контроля эффективности трансфекции.

Липопротеиды.      ЛВП были выделены из плазмы крови человека последовательным центрифугированием. Аполипопротеин-AI был выделен из фракции ЛВП как описано ранее [22]. ЛНП выделяли из плазмы крови человека последовательным центрифугированием и ацетилировали как описано Basu et al. [23]. Аполипопротеин-дефицитную плазму получали из плазмы доноров-нормолипидемиков путем осаждения апоВ-содержащих липопротеидов с 0,9 г/л сульфата декстрана / 45 ммоль/л MgCl₂.

Иммуноблоттинг.             Клетки обрабатывали, как указано, промывали и снимали с подложки. Белки были разделены на SDS-PAGE с последующим иммуноблоттингом. Коротко, PVDF мембраны локировали 2,5% раствором обезжиренного молока, промывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антителами против ABCA1 (моноклональные, NDF4C2 [24]), ABCG1 (поликлональные, Abcam, ab52617), PLTP (поликлональные, Abcam ab7735), SR-B1 (поликлональные, Abcam ab369), caveolin-1 (поликлональные, BD Transduction Laboratories) или myc (моноклональные, клон 9Е10), затем в течение 1 ч вторичными антителами анти-кролик или анти-IgG мыши или биотин-анти-мышь IgM и стрептавидин- HRP конъюгатом. Полосы были визуализированы с помощью SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate kit (Pierce), относительная интенсивность полос была количественно определена с помощью денситометрии. Нагрузка b-актина  был использована как контроль (моноклональные антитела от Sigma).

Отток холестерина.         Клеточный холестерин метили путем инкубации клеток в среде с сывороткой, содержащей [1α,2α(n)-³H]-холестерин (Amersham, окончательная радиоактивность 0,5 МБк/мл) в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе. Затем клетки промывали и инкубировали в течение 18 ч при 37°С в среде без сыворотки, промывали и инкубировали еще в течение 3 ч при 37°С в среде без сыворотки, содержащей 30  мкг/мл обеслипиженного апоА-I, либо или ЛВП, либо 2%  апоВ-обедненной плазмы человека, либо 5 ммоль/л метил-b-циклодекстрин. Среда была собрана, отцентрифугирована в течение 15 мин при 4°С при 10000 x g и аликвоты супернатанта подсчитаны в b-счетчике. Клетки также собирали и считали радиоактивность, связанную с ними. Отток холестерина выражели как долю [³H] холестерина, перенесенного из клеток в среду. Содержание холестерина измеряли с помощью колориметрического метода.

Перенос холестерина.       Относительное содержание холестерина в обогащенных холестерином доменах и перенос холестерина в эти домены были оценены как описано ранее [25]. Вкратце, клетки были помечены [¹⁴С] холестерином (окончательная радиоактивность 0,5 МБк/мл) в течение 48 ч при 37°С, промыты и помечены [³Н] ацетатом (окончательная радиоактивность 5 МБк/мл) в течение 3 ч при 15°C. Клетки затем нагревали до 37°С в течение 20 мин, охлаждали до 4°С, промывали и обрабатывали холестериноксидазой (1 ед/мл) в течение 3 ч при температуре 4°С. Клеточные липиды были выделены и разделены тонкослойной хроматографией как описано [25].

Связывание апоА-I.            Для измерения связывания апоА-I, специфического для ABCA1, был использован анализ перекрестного связывания как описано Wang et al. [26]. Вкратце, трансфицированные клетки инкубировали с апоА-I  (50 мкг/мл) в течение 1 ч при 37°С и промывали.  Дитиобис (сукцинимидил) пропионата (DSP, Pierce) был добавлен в конечной концентрации 250 мкмоль/л и клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки лизировали буфером RIPA и инкубировали с поликлональными анти-ABCA1 антителами (Novus) в течение ночи при температуре 4°С. Комплекс ABCA1 с антителами иммунопреципитировали с использованием Protein G Sepharose совместной инкубацией в течение 4 часов при температуре 4°С. Иммунопреципитированные и несвязанные фракции разводили буфером, содержащим 5% 2-меркаптоэтанола, кипятили 5 мин и проводили 12% SDS-PAGE и Вестерн-блот; апоА-I  обнаруживали с помощью моноклональных анти-апоА-I антител AI-4.1.

Статистический анализ.             Все эксперименты были воспроизведены 2-4 раза; представлены репрезентативные эксперименты. Если не указано иное, экспериментальная группа состояла из четырех повторов; представлены данные среднего значения ± SEM. Для определения статистической значимости различий использовали T-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ. 

Оверэкспрессия различных белков и отток холестерина на апоА-I или ЛВП in vitro. Восемь белков, вовлеченных в отток холестерина, были экспрессированы в мышиных макрофагах RAW 264.7 с использованием ранее описанного протокола [20], который обеспечивает 80% эффективности трансфекции и равномерную выраженность гетерологичных генов во всей клеточной популяции. В стандартных условиях эксперимента клетки не были нагружены холестерином, так как нагрузка усиливает несколько путей оттока холестерина, включая ABC переносчики. Когда обезлипиженный апоА-I был использован в качестве акцептора, оверэкспрессия ABCA1 повышала отток холестерина в 2,4 раза,  в то время как экспрессия CYP27A1, PLTP и SR-B1 повышала отток холестерина примерно в 2 раза (Рисунок 1А). Оверэкспрессия ABCG1, кавеолина-1, и апоА-I не влияла на уровень оттока холестерина на апоА-I (Рисунок 1А); как было показано ранее, оверэкспрессия CETP также не влияет на уровень оттока холестерина [28]. Когда в качестве акцептора были использованы ЛВП, оверэкспрессия кавеолина-1 увеличивала отток холестерина в 1,8 раза; небольшое, но статистически значимое увеличение оттока холестерина наблюдалось также после оверэкспрессии ABCG1 и SR-B1 (Рисунок 1В). Оверэкспрессия ABCA1 не влияла на уровень оттока холестерина на ЛВП. Умеренное влияние оверэкспрессии ABCA1 на отток холестерина на ЛВП наблюдали Okuhira et al. [29]; это было связано с оттоком на обезлипиженый апоА-I диссоциированый от ЛВП. Количество обезлипиженного апоА-I в свежем препарате ЛВП, который использовали в этом исследовании, не поддавалось определению с помощью PAGE и Вестерн-блота; если же небольшое количество апоА-I все-таки присутствовало, то этого было недостаточно, чтобы внести свой вклад в общий отток на ЛВП.

Рисунок 1 - Оверэкспрессия различных генов и отток холестерина из макрофагов

Примечания.

RAW264.7 клетки были трансфицированы указанными выше генами. Клетки были помечены [³H] холестерином и отток холестерина на обезлипиженный апоА-I (А) или ЛВП (B) (30 мкг/мл) был оценен как описано в разделе «Методы исследования». Конечная концентрация и отток холестерина выражены как доля [³H] холестерина переносимого из клетки в среду.  Приведены средние значения четырех экспериментов ± SEM. *Р<0,05 по сравнению с ложнотрансфицированными клетками.

Небольшой эффект оверэкспрессии ABCG1 на отток холестерина на ЛВП был неожиданным и не согласовывался с результатами исследований оверэкспрессии ABCG1 в других типах клеток [30], но не слишком отличался от результатов единственного исследования оверэкспрессии ABCG1 в мышиных макрофагах [10]. Одна из причин этого может быть то, что в настоящем исследовании мы использовали конъюгат ABCG1-GFP, который может иметь свойства, отличные от свойств ABCG1. Поэтому мы использовали другую конструкцию - ABCG1-myc. ABCG1-myc также вызвал лишь небольшую стимуляцию оттока холестерина из RAW 264.7 макрофагов.

Другой причиной скромного влияния оверэкспрессии ABCG1 в макрофагах может быть высокий уровень ABCG1 в RAW 264.7 клетках (о чем свидетельствует высокий уровень оттока на ЛВП с неактивированных RAW 264.7 клеток), снижающий возможные эффекты его оверэкспрессии. Действительно, относительно высокий уровень ABCG1 был обнаружен в неактивированных RAW 264.7 клетках (Рисунок 2А) и, хотя трансфекция увеличивала уровень ABCG1 на 70% (6,1 против 3,6 в относительных единицах, Рисунок 2A), концентрация эндогенного ABCG1 могла уже приближаться к функционально насыщающему уровню.

Для дальнейшей проверки этой возможности мы рассмотрели оверэкспрессию ABCG1 в трех других типах клеток. Были исследованы две клеточные лини человека: HeLa клетки – клеточная модель отсутствия ABC транспортеров и THP-1 макрофаги человека, о которых известно, чтобы они обладают низким уровнем ABC транспортеров, если активированы агонистом LXR. По сравнению с RAW 264.7 клетками, отток холестерина на ЛВП из трансфицированных HeLa и THP-1 клеток было в 1,6 раза и в 3,6 раза ниже, соответственно. Оверэкспрессия как ABCG1-myc, так и ABCG1-GFP повышала отток холестерина в 1,5 раза и 7,5 раза в HeLa и ТНР-1 клетках, соответственно (Рисунок 2В). Третья линия клеток, которая была исследована, были фибробласты мыши 3T3. Отток холестерин на ЛВП из этих клеток было 1,8 раза выше по сравнению с RAW 264.7 клетками, а оверэкспрессия ABCG1 не влияла на уровень оттока холестерина на ЛВП (Рисунок 2D). Таким образом, представляется, что оверэкспрессия ABCG1 стимулирует отток холестерина на ЛВП из клеток с низким базальным уровнем оттока, но не из клеток с высоким базальным уровнем оттока холестерина, что указывает на возможность того, что в последних уровень ABCG1 может быть функционально насыщенным. Однако, мы не можем исключить возможность видовых различий оверэкспрессии ABCG1, стимулирующей отток холестерина из клеток человека, но не из мышиных клеток.

Для проверки влияния оверэкспрессии сочетания белков был использован следующий подход. Клетки были совместно трансфицированы одним из двух белков, которые имели наибольший эффект на уровень оттока холестерина, т.е. ABCA1 или CYP27A1 в случае оттока на апоА-I и кавеолин-1 или SR-B1 в случае оттока на ЛВП, а другим был один из остальных семи белков. При комбинации из двух белков, которые вызывали наибольший эффект, клетки были совместно трансфицированы одним из оставшихся шести белков, и так далее. Максимальное количество белков, которое можно было совместно экспрессировать, было четыре; совместная экспрессия пятого белка вызвало резкое снижение уровня оттока холестерина, независимо от того, какая была комбинация.

Рисунок 2 - Влияние оверэкспрессии ABCG1 на относительное количество ABCG1 изобилие в RAW 264.7 клетках (А) и отток холестерина на ЛВП из клеток HeLa (B), THP-1 макрофагов (C) и фибробластов 3T3 (D)

Примечания
1 А. RAW 264.7 клетки были трансфицированы ABCG1-GFP и относительное количество ABCG1 оценивали Вестерн-блотингом.
2 B-D. HeLa клетки (B), THP-1 макрофаги человека (C) и  мышиные фибробласты 3T3 (D) были трансфицированных как указано, помечены [³H]холестерином и отток холестерина на ЛВП (конечная концентрация 30 мкг/мл) был оценен как описано в разделе «Методы исследования».

3 Отток холестерин был выражен как доля [³H]холестерина, перенесенного с клеток в среду. 

4 Приведены средние значения четырех экспериментов ± SEM.

5 * Р <0,05 по сравнению с ложнотрансфицированными клетками.

Результаты анализа эффектов оверэкспрессии комбинации белков представлены на Рисунке 3. Когда апоА-I был использован в качестве акцептора, оверэкспрессия SR-B1 или CYP27A1 вместе с ABCA1 была аддитивной в отношении стимуляции оттока холестерина, а добавление PLTP не вызывало аддитивности (Рисунок 3А). Сочетание белков, которые вызвали наивысшее стимулирование оттока холестерина, было ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1, это сочетание приводило к 4,3-кратному стимулированию оттока холестерина (Рисунок 3А). Сочетание SR-B1 + PLTP + CYP27A1 без ABCA1 было менее эффективным, вызывая 2-кратное увеличение оттока холестерина. Когда ЛВП были использованы в качестве акцептора, оверэкспрессия SR-B1 вместе с кальвеолином-1 немного увеличивала отток холестерина, разница с оверэкспрессией только кальвеолином-1, однако, не было статистически значимой (Рисунок 3В). Все другие комбинации оказывали лишь минимальное влияние на уровень оттока холестерина на ЛВП. Важно отметить, что оверэкспрессия сочетанием ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1, которое вызвало значительное повышение уровня отока холестерина на апоА-I, приводило лишь к небольшой (30%) повышению уровня оттока холестерина на ЛВП (Рисунок 3В).

Рисунок 3 - Оверэкспрессия сочетания генов и отток холестерина из макрофагов

Примечания
1 RAW264.7 клетки были трансфицированных указанными генами. Клетки были помечены [³H]холестерином и отток холестерина на обехлипиженный апоА-I (А) или ЛВП (B) (конечная концентрация 30 мкг/мл) был оценен как описано в разделе «Методы исследования».

2 Отток холестерин был выражен как доля [³H]холестерина, перенесенного с клеток в среду. 

3 Приведены средние значения четырех экспериментов ± SEM.

4 * р <0,05 по сравнению с ложнотрансфицированными клетками.
 5 # р <0,01 по сравнению с ABCA1.

Хотя отток меченого холестерина на обездипиженный апоА-I отражает перемещение массы холестерина, отток на ЛВП сопровождает холестериновый обмен между клетками и ЛВП, поэтому не обязательно отражает перемещение массы холестерина. Когда общая масса холестерина измерялась в клетках и в культуральной среде, инкубация с ЛВП приводила к тому, что 4% клеточного холестерина перемещалось на ЛВП через 2 ч. Однако, не было статистически значимых различий между ложнотрансфицированными клетками и клетками, трансфицированными ABCA1, ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1,  кальвеолином-1 или кальвеолином-1 + SR-B1.
            Для дальнейшей характеристики влияние оверэкспрессии комбинации белков на отток холестерина вышеупомянутые эксперименты были повторены с клетками, нагруженными холестерином. Трансфицированные клетки были  нагружены холестерином путем инкубации с ацетилированными ЛВП (50 мкг/мл) течение 24 ч. Когда апоА-I был использован в качестве акцептора, трансфекция ABCA1 и  ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1 повышала отток холестерина в 6 и 11 раз, соответственно (Рисунок 4). Трансфекции клеток кавеолином-1 незначительно увеличила отток холестерина (р = 0,04), в то время как при трансфекции сочетанием кавеолина-1 + SR-B1 не было статистически значимого эффекта (Рисунок 4). Когда ЛВП были использовани в качестве акцептора, только трансфекция кавеолином-1 увеличивала отток холестерина (Рисунок 4В). Эффект кавеолина-1 был ослабленным в холестерин-нагруженных клетках, что позволяет предположить, что вклад этого пути в оттоке холестерина на ЛВП, возможно, изменился в результате холестериновой нагрузки, например, из-за повышения синтеза ABC транспортеров.

Рисунок 4 - Оверэкспрессия сочетания генов и отток холестерина из нагруженых холестерином макрофагов

Примечания/
1 RAW264.7 клетки были трансфицированных указанными генами. Клетки были нагружены холестерином путем инкубации с ацетилированными ЛНП (50 мкг/мл) в течение 24 ч и одновременно помечены [³H] холестерином.

2 Отток холестерина на обезлипиженный апоА-I (А) или ЛВП (B) (конечная концентрация и 30 мкг/мл) был оценен как описано в разделе «Методы исследования». Отток холестерин был выражен как доля [³H]холестерина, перенесенного с клеток в среду. 

3 Приведены средние значения четырех экспериментов ± SEM.

4 * р <0,05 по сравнению с ложнотрансфицированными клетками.

Для оценки прироста относительного количества каждого белка после оверэкспрессии комбинации генов, клетки были совместно трансфицированы ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1 или трансфицированы только кавеолином-1, после чего с помощью Вестерн-блотинга оценивалась экспрессия каждого белка и сравнивалась с его экспрессией в ложнотрансфицированных клетках (Рисунок 5). Относительное количество ABCA1, SR-B1 и PLTP было увеличено в 1,9, 3,5 и 1,8 раза, соответственно (Рисунок 5). Эти значения представляют собой комбинацию относительного содержания эндогенных и гетерологичных белков и, хотя нельзя исключить, что экспрессия эндогенных белков может оказывать влияние, наиболее вероятно, что в основном прирост относительного количества был обусловлен гетерологичной экспрессией. Исключением является прирост относительного количества эндогенного ABCA1, на который могут повлиять CYP27A1 и PLTP; этот вопрос рассматривается ниже. Оверэкспрессию CYP27A1 определяли с использованием анти-myc антител для сравнения с базальной экспрессией CYP27A. Оверэкспрессия кавеолина-1 приводила к 1,6-кратному увеличению его относительного количества (Рисунок 5,В). Трансфекция клеток не влияла на относительное количество b-актина (Рисунок 5А,В).   

Рисунок 5 - Влияние оверэкспрессии комбинации генов белков на их относительное количество

Примечания
1 RAW 264.7 клетки были трансфицированы ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1 (А) или кавеолином-1 (B).

2 Относительное количество индивидуальных белков оценивали с помощью иммуноблоттинга и количественной денситометрии как описано в разделе «Методы исследования».

3 Числа под пятнами показывают увеличение  соответствующих белков (кратность - относительно ложнотрансфицированных клеток).

Отток холестерина ин витро.    Тестирование эффектов оверэкспрессии различных белков на отток холестерина привело к созданию двух различных клеточных моделей. В одной из моделей на RAW 264.7 клетках совместная трансфекция ABCA1 или ABCA1 + SR-B1 + CYP27A1 + PLTP повышала отток холестерина на обезлипиженный апоА-I, но не на ЛВП. На другой модели на RAW 264.7 клетках трансфицированных кавеолином-1 или кавеолином-1 + SR-B1 повышался отток холестерина на  ЛВП, но не на обежлипиженный апоА-I. Эти модели предоставляют возможность сравнить вклад этих двух акцепторов в экспорт холестерина. Для тестирования оттока in vitro мы удалили апоВ-содержащие липопротеиды из плазмы путем осаждения декстрансульфатом, минимизируя неспецифической (диффузионный) отток. Плазма была использована в концентрации 2%  линейной части кривой зависимости от дозы. Когда апоВ-обедненная плазма крови человека была использована в качестве акцептора, оверэкспрессия ABCA1 или ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1 стимулировала отток холестерина на 30% и 40%, соответственно, в то же время оверэкспрессия кавеолина-1 или кавеолина-1 + SR- B1 не влияла на уровень оттока холестерина истечения (Рисунок 6). Последний результат был неожиданным, так как липидированные ЛВП представляют собой основную часть плазменного апоА-I; это факт указывает на то, что плазменный уровень ЛВП не всегда является основным фактором плазмы, определяющим потенциал оттока холестерина [31, 32]. Мы предполагаем, что увеличение оттока холестерина в основном происходит за счет оттока на обезлипиженый апоА-I. Наши данные указывают на то, что уровень оттока холестерина из макрофагов может быть повышен за счет манипулирования клеточными путями, ответственными за отток на апоА-I.

Рисунок 6 - Оверэкспрессия различных генов и отток холестерина в  плазме крови человека

Примечания

1 RAW264.7 клетки были трансфицированы указанными генами. Клетки были помечены [³H]холестерином, и оттток холестерина в 2% апоВ-обедненной плазме крови человека оценивается как описано в разделе «Методы исследования».

2 Отток холестерин был выражен как доля [³H]холестерина, перенесенного с клеток в среду. 

3 Приведены средние значения четырех экспериментов ± SEM.

4 * р <0,05 по сравнению с ложнотрансфицированными клетками.

                                  ОБСУЖДЕНИЕ          

Было описано множество путей оттока холестерина, но относительный вклад каждого из них в экспорт холестерина из клеток остается неясным. Инактивация конкретных путей оттока в некоторых клетках приводит к значительному нарушению экспорта холестерина и накоплению внутриклеточного холестерина, в то время как в других клетках та же инактивации оказывает минимальное влияние на отток холестерина и накопление холестерина. Например, нокаут ABCA1 в макрофагах мыши приводит к тяжелым нарушением оттока холестерина и к накоплению холестерина в этих клетках [36], но накопление холестерина не наблюдается в фибробластах Танжера или эндотелиальных клетках при нехватке ABCA1 [11]. Кроме того, оверэкспрессия CYP27A1 [4, 20], кавеолина-1 [5] и ABCG1 [30] приводит к значительному повышению оттока холестерина in vitro, но, в то же время, нокаут этих генов in vivo  имеет только умеренное влияние на накопление холестерина в макрофагах [19, 37, 38]. Эти и другие примеры показывают, что различные клетки могут использовать различные пути для оттока холестерина и для поддержания гомеостаза холестерина и/или имеет место значительная избыточность в путях экспорта холестерина. Другой возможностью является то, что использование различных путей зависит от преобладающих метаболических обстоятельств и внутриклеточной локализации избыточного холестерина. Так, клеточный пул холестерина в макрофагах, перегруженых ЛНП, более эффективно уменьшается при использовании ABCG1-зависимого пути, в то время как клеточный пул в клетках, перегруженых ацетилированными ЛНП, снижается в основном за счет ABCA1-зависимого пути [39].

            Главным результатом настоящего исследования является то, что повышение оттока холестерина при использовании апоА-I в качестве акцептора приводит к увеличению экспорта холестерина из макрофагов, при этом использование путей оттока, которые используют ЛВП в качестве акцептора, было неэффективным. Тот факт, что отток холестерина был усилен через использование апоА-I, но не ЛВП, указывает на то, что первый путь, возможно, имеет основной вклад в общий экспорт холестерина или стимулирующие его вещества потенциально могут быть объектами для разработки терапии. Это согласуется с выводами, что инактивация в макрофагах ABCA1, который является основным элементом пути оттока холестерина с использованием апоА-I, способствует атеросклерозу [36], в то время оверэкспрессия ABCA1 защищает от атеросклероза [15]. Кроме того, в соответствии с последними работами Adorni et al. [40], ABCA1-зависимый отток в сыворотке крови человека ex vivo является преобладающим путем оттока холестерина. Инактивация или оверэкспрессия ключевых элементов пути оттока, который использует ЛВП как первичный акцептор, таких, как ABCG1, как было показано, имеют ограниченное влияние на развитие атеросклероза [19]. Следует признать, однако, что последствия оверэкспрессии и инактивации белков не обязательно являются взаимодополняющими. Например, экспрессия белка не может повлиять на функцию, если белок присутствует в функционально насыщенной концентрации, как было бы в случае ABCG1. Таким образом, наши данные полезны скорее для разработки возможных подходов к повышению обратного транспорта холестерина, а не для объяснения возможных причин его нарушения.

            Еще одним выводом из нашего исследования является то, что CYP27A1, PLTP и SR-B1 дополняют ABCA1-зависимый отток холестерина на апоА-I. Точный механизм взаимодействия между этими белками и роль каждого отдельного белка остаются неясными. Сравнение оттока холестерина после различных трансфекций ясно указывает на необходимость наличия ABCA1 в этой комбинации, посколько было достигнуто лишь умеренное увеличение оттока холестерина, когда ABCA1 был исключен из комбинации, и даже этот эффект объясняется, вероятно, влиянием оверэкспрессированных белков на относительное содержание ABCA1. Однако, относительное содержание ABCA1 в клетках и содержание ABCA1 на поверхности клетки не увеличиваются в результате совместной экспрессии ABCA1 + PLTP + CYP27A1 + SR-B1 по сравнению с оверэкспрессией одного ABCA1. Содержание холестерина в плазматической мембране также не изменялось, и, хотя ABCA1 увеличил содержание холестерина в обогащенных холестерином доменах, совместная экспрессия трех других генов не вызывала его дальнейшего увеличения. Ни перенос холестерина на плазматическую мембрану, ни связывание апоА-I с ABCA1 не изменялись в результате совместной трансфекции. Однако, общее количество апоА-I связанного с клетками трансфицированными ABCA1 + PLTP + CYP27A1 + SR-B1 было двукратным по сравнению с ложнотрансфицироваными и ABCA1 трансфицированными клетками, что может объяснить увеличение оттока холестерина. Дополнительные апоА-I сайты связывания не были найдены на четырех экспрессируемых белках, и их природа остается неясной. Недавно было предположено, что для эффективного оттока холестерина требуется формирование обогащенных фосфолипидами изогнутых доменов мембраны, обладающих высоким сродством связывания с апоА-I [41, 42]. Вполне возможно, что оверэкспрессия сочетания белков стимулирует образование таких доменов и усиливает ассоциацию апоА-I с этими доменами или их белковыми и/или липидными компонентами. Роль отдельных белков, особенно SR-B1, который вовлечен в основном в отток холестерина на ЛВП, остается неясным и механизм еще не определен.
            Итак, мы показали, что отток холестерина на апоА-I, возможно, вносит основной вклад в уровень экспорта холестерина из макрофагов. Ключевым элементом этого пути, по-видимому, является ABCA1, а CYP27A1, PLTP и SR-B1 играют вспомогательную роль.

ЛИТЕРАТУРА

1 Oram, J.F.,  and A.M. Vaughan. ABCA1-mediated transport of cellular cholesterol and phospholipids to HDL apolipoproteins. // Curr. Opinion Lipidol.  - 2000. - Vol. 11 - P. 253-260.

2 Kennedy, M.A., G.C. Barrera, K. Nakamura, A. Baldan, P. Tarr, M.C. Fishbein, J. Frank, O.L. Francone,  and P.A. Edwards. ABCG1 has a critical role in mediating cholesterol efflux to HDL and preventing cellular lipid accumulation. // Cell Metab - 2005. - Vol. 1 - P. 121-131.

3 Ji, Y., B. Jian, N. Wang, Y. Sun, M.L. Moya, M.C. Phillips, G.H. Rothblat, J.B. Swaney,  and A.R. Tall. Scavenger receptor BI promotes high density lipoprotein-mediated cellular cholesterol efflux. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272 - P. - 20982-20985.

4 Escher, G., Z. Krozowski, K.D. Croft,  and D. Sviridov. Expression of Sterol 27-Hydroxylase (CYP27A1) Enhances Cholesterol Efflux. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278 - P. 11015-11019.

5 Fu, Y., A. Hoang, G. Escher, R.G. Parton, Z. Krozowski,  and D. Sviridov. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. //  Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279 - P. 14140-14146.

6 Major, A.S., D.E. Dove, H. Ishiguro, Y.R. Su, A.M. Brown, L. Liu, K.J. Carter, M.F. Linton,  and S. Fazio. Increased Cholesterol Efflux in Apolipoprotein AI (ApoAI)-Producing Macrophages as a Mechanism for Reduced Atherosclerosis in ApoAI(-/-) Mice. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2001. - Vol. 21 - P. 1790-1795.

7 Oram, J.F., G. Wolfbauer, A.M. Vaughan, C. Tang,  and J.J. Albers. Phospholipid Transfer Protein Interacts with and Stabilizes ATP-binding Cassette Transporter A1 and Enhances Cholesterol Efflux from Cells. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278 - P. 52379-52385.

8 Zhang, Z., S. Yamashita, K. Hirano, Y. Nakagawa-Toyama, A. Matsuyama, M. Nishida, N. Sakai, M. Fukasawa, H. Arai, J. Miyagawa,  and Y. Matsuzawa. Expression of cholesteryl ester transfer protein in human atherosclerotic lesions and its implication in reverse cholesterol transport. // Atherosclerosis - 2001. - Vol. 159 - P. 67-75.

9 Gelissen, I.C., M. Harris, K.-A. Rye, C. Quinn, A.J. Brown, M. Kockx, S. Cartland, M. Packianathan, L. Kritharides,  and W. Jessup. ABCA1 and ABCG1 Synergize to Mediate Cholesterol Export to ApoA-I. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2006. - Vol. 26 - P. 534-540.

10 Wang, X., H.L. Collins, M. Ranalletta, I.V. Fuki, J.T. Billheimer, G.H. Rothblat, A.R. Tall,  and D.J. Rader. Macrophage ABCA1 and ABCG1, but not SR-BI, promote macrophage reverse cholesterol transport in vivo. // J. Clin. Invest. - 2007. - Vol. 117 - P. 2216-2224.

11 Fielding, P.E., K. Nagao, H. Hakamata, G. Chimini,  and C.J. Fielding. A two-step mechanism for free cholesterol and phospholipid efflux from human vascular cells to apolipoprotein A-1. // Biochemistry - 2000. - Vol. 39 - P. 14113-14120.

12 Chen, W., D.L. Silver, J.D. Smith,  and A.R. Tall. Scavenger receptor-BI inhibits ATP-binding cassette transporter 1- mediated cholesterol efflux in macrophages. // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275 - P. 30794-30800.

13 Yvan-Charvet, L., T.A. Pagler, N. Wang, T. Senokuchi, M. Brundert, H. Li, F. Rinninger,  and A.R. Tall. SR-BI inhibits ABCG1-stimulated net cholesterol efflux from cells to plasma HDL. // J. Lipid Res. - 2008. - Vol. 49 - P. 107-114.

14 Wang, M.-D., V. Franklin, M. Sundaram, R.S. Kiss, K. Ho, M. Gallant,  and Y.L. Marcel. Differential Regulation of ATP Binding Cassette Protein A1 Expression and ApoA-I Lipidation by Niemann-Pick Type C1 in Murine Hepatocytes and Macrophages. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282 - P. 22525-22533.

15 Singaraja, R.R., C. Fievet, G. Castro, E.R. James, N. Hennuyer, S.M. Clee, N. Bissada, J.C. Choy, J.-C. Fruchart, B.M. McManus, B. Staels,  and M.R. Hayden. Increased ABCA1 activity protects against atherosclerosis. // J. Clin. Invest. - 2002. 110 - P. 35-42.

16 Joyce, C.W. - Vol. M.J.A. Amar, G. Lambert, B.L. Vaisman, B. Paigen, J. Najib-Fruchart, R.F. Hoyt, Jr., E.D. Neufeld, A.T. Remaley, D.S. Fredrickson, H.B. Brewer, Jr.,  and S. Santamarina-Fojo. The ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) modulates the development of aortic atherosclerosis in C57BL/6 and apoE-knockout mice. // PNAS - 2002. - Vol. 99 - P. 407-412.

17 Out, R., M. Hoekstra, I. Meurs, P. de Vos, J. Kuiper, M. Van Eck,  and T.J.C. Van Berkel. Total Body ABCG1 Expression Protects Against Early Atherosclerotic Lesion Development in Mice. Arterioscler. // Thromb. Vasc. Biol. - 2007. - Vol. 27 - P. 594-599.

18 Basso, F., M.J. Amar, E.M. Wagner, B. Vaisman, B. Paigen, S. Santamarina-Fojo,  and A.T. Remaley. Enhanced ABCG1 expression increases atherosclerosis in LDLr-KO mice on a western diet. // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 2006. - Vol. 351 - P. 398-404.

19 Out, R., M. Hoekstra, R.B. Hildebrand, J.K. Kruit, I. Meurs, Z. Li, F. Kuipers, T.J.C. Van Berkel,  and M. Van Eck. Macrophage ABCG1 Deletion Disrupts Lipid Homeostasis in Alveolar Macrophages and Moderately Influences Atherosclerotic Lesion Development in LDL Receptor-Deficient Mice. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2006. - Vol. 26 - P. 2295-2300.

20 Escher, G., A. Hoang, S. Georges, U. Tchoua, A. El-Osta, Z. Krozowski,  and D. Sviridov. Demethylation using the epigenetic modifier, 5-azacytidine, increases the efficiency of transient transfection of macrophages. // J. Lipid Res. - 2005. - Vol. 46 - P. 356-365.

21 Pyle, L., D. Sviridov,  and N. Fidge. Characterization of the maturation of human pro-apolipoprotein A-I in an in vitro model. // Biochemistry - 2001. - Vol. 40 - P. 3101-3108.

22 Sviridov, D., L. Pyle,  and N. Fidge. Efflux of cellular cholesterol and phospholipid to apolipoprotein A-I mutants. // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271 - P. 33277-33283.

23 Basu, S.K., J.L. Goldstein, G.W. Anderson,  and M.S. Brown. Degradation of cationized low density lipoprotein and regulation of cholesterol metabolism in homozygous familial hypercholesterolemia fibroblasts. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A - 1976. - Vol. 73 - P. 3178-3182.

24 Mukhamedova, N., Y. Fu, M. Bukrinsky, A.T. Remaley,  and D. Sviridov. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. // Biochemistry - 2007. - Vol. 46 - P. 9388-9398.

25 Sviridov, D., N. Fidge, G. Beaumier-Gallon,  and C. Fielding. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae). // Biochem. J. - 2001. - Vol. 358 - P. 79-86.

26 Wang, N., D.L. Silver, P. Costet,  and A.R. Tall. Specific binding of ApoA-I, enhanced cholesterol efflux, and altered plasma membrane morphology in cells expressing ABC1. J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275 - P. 33053-33058.

27 Folch, J., M. Lees,  and G.M. Sloane-Stainley. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues. // J. Biol. Chem. - 1957. - Vol. 226 - P. 497-509.

28. Tchoua, U., W. D'Souza, N. Mukhamedova, D. Blum, E. Niesor, J. Mizrahi, C. Maugeais,  and D. Sviridov. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. // Cardiovasc. Res. - 2008. - Vol. 77 - P. 732-739.

29 Okuhira, K.-i., M. Tsujita, Y. Yamauchi, S. Abe-Dohmae, K. Kato, T. Handa,  and S. Yokoyama. Potential involvement of dissociated apoA-I in the ABCA1-dependent cellular lipid release by HDL. // J. Lipid. Res. - 2004. - Vol. 45 - P. 645-652.

30 Wang, N., D. Lan, W. Chen, F. Matsuura,  and A.R. Tall. ATP-binding cassette transporters G1 and G4 mediate cellular cholesterol efflux to high-density lipoproteins. // PNAS - 2004. - Vol. 101 - P. 9774-9779.

31 Sviridov, D., A. Hoang, E. Ooi, G. Watts, P.H.R. Barrett,  and P. Nestel. Indices of reverse cholesterol transport in subjects with metabolic syndrome after treatment with rosuvastatin. // Atherosclerosis - 2008. - Vol. 197 - P. 732-739.

32 Catalano, G., E. Duchene, Z. Julia, W. Le Goff, E. Bruckert, M.J. Chapman,  and M. Guerin. Cellular SR-BI and ABCA1-mediated cholesterol efflux are gender-specific in healthy subjects. // J. Lipid Res. - 2008. - Vol. 49 - P. 635-643.

33 Calpe-Berdiel, L., N. Rotllan, X. Palomer, V. Ribas, F. Blanco-Vaca,  and J.C. Escola-Gil. Direct evidence in vivo of impaired macrophage-specific reverse cholesterol transport in ATP-binding cassette transporter A1-deficient mice. // Biochim. Biophys. Acta - 2005. - Vol. 1738 - P. 6-9.

34 Nagao, K., K. Takahashi, K. Hanada, N. Kioka, M. Matsuo,  and K. Ueda. Enhanced ApoA-I-dependent Cholesterol Efflux by ABCA1 from Sphingomyelin-deficient Chinese Hamster Ovary Cells. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282 - P. 14868-14874.

35 Vaughan, A.M.,  and J.F. Oram. ABCA1 redistributes membrane cholesterol independent of apolipoprotein interactions. // J. Lipid Res. - 2003. - Vol. 44 - P. 1373-1380.

36 Aiello, R.J., D. Brees, P.-A. Bourassa, L. Royer, S. Lindsey, T. Coskran, M. Haghpassand,  and O.L. Francone. Increased Atherosclerosis in Hyperlipidemic Mice With Inactivation of ABCA1 in Macrophages. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2002. - Vol. 22 - P. 630-637.

37 Meir, K., D. Kitsberg, I. Alkalay, F. Szafer, H. Rosen, S. Shpitzen, L.B. Avi, B. Staels, C. Fievet, V. Meiner, I. Bjorkhem,  and E. Leitersdorf. Human Sterol 27-Hydroxylase (CYP27) Overexpressor Transgenic Mouse Model. Evidence against 27-hydroxycholesterol as a critical regulator of cholesterol homeostasis. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277 - P. 34036-34041.

38 Razani, B., T.P. Combs, X.B. Wang, P.G. Frank, D.S. Park, R.G. Russell, M. Li, B. Tang, L.A. Jelicks, P.E. Scherer,  and M.P. Lisanti. Caveolin-1-deficient Mice Are Lean, Resistant to Diet-induced Obesity, and Show Hypertriglyceridemia with Adipocyte Abnormalities. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277 - P. 8635-8647.

39 Wang, M.-D., R.S. Kiss, V. Franklin, H.M. McBride, S.C. Whitman,  and Y.L. Marcel. Different cellular traffic of LDL-cholesterol and acetylated LDL-cholesterol leads to distinct reverse cholesterol transport pathways. // J. Lipid Res. - 2007. - Vol. 48 - P. 633-645.

40 Adorni, M.P., F. Zimetti, J.T. Billheimer, N. Wang, D.J. Rader, M.C. Phillips,  and G.H. Rothblat. The roles of different pathways in the release of cholesterol from macrophages. // J. Lipid Res. - 2007. - Vol. 48 - P. 2453-2462.

41 Vedhachalam, C., P.T. Duong, M. Nickel, D. Nguyen, P. Dhanasekaran, H. Saito, G.H. Rothblat, S. Lund-Katz,  and M.C. Phillips. Mechanism of ATP-binding Cassette Transporter A1-mediated Cellular Lipid Efflux to Apolipoprotein A-I and Formation of High Density Lipoprotein Particles. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282 - P. 25123-25130.

42 Hassan, H.H., M. Denis, D.-Y.D. Lee, I. Iatan, D. Nyholt, I. Ruel, L. Krimbou,  and J. Genest. Identification of an ABCA1-dependent phospholipid-rich plasma membrane apolipoprotein A-I binding site for nascent HDL formation: implications for current models of HDL biogenesis. // J. Lipid Res. - 2007. - Vol. 48 - P. 2428-2442. 

Работа была поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации.