|
Авторы:
Мухамедова
Н. М., Свиридов Д. Д., Карагодин В. П., Мельниченко А. А., Мясоедова В. А.,
Орехова В. А., Собенин И. А., Орехов А. Н.
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский
институт общей патологии и патофизиологии РАМН (г. Москва)
Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.
РЕЗЮМЕ
Противовоспалительное
действие липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) на эндотелиальные клетки хорошо
описано, подобные эффекты на моноцитах изучены в меньшей степени. Моноциты
человека выделяли из цельной крови с последующей оценкой активации/экспрессии CD11b и клеточной
адгезии в условиях сдвига потока. ЛПВП вызывали зависимое от дозы снижение
активации CD11b, индуцированной активатором протеинкиназы С
форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) или антагонистами, зависимыми от
рецептора. Было обнаружено, что составляющей частью ЛВП, ответственной за
противовоспалительное действие на активацию CD11b, является
аполипопротеин A-I (apoA-I). Циклодекстрин, но не комплекс циклодекстрин/холестерин,
также подавлял индуцированную РМА активацию CD11b, вовлекая
отток холестерина как основной механизм. В дальнейшем это было подтверждено
данными о том, что содержание холестерина в липидных рафтах уменьшается после
добавления акцепторов холестерина. Блокирование АВСА1 антителами к АВС1
устраняло эффект apoA-I. Кроме того, моноциты, полученные от больных с
болезнью Танжера, четко подтвердили необходимость АВСА1 в ингибировании CD11b,
опосредованном apoA-I. Противовоспалительные эффекты apoA-I были
обнаружены также на функциональных моделях, включающих адгезию клеток к
монослою эндотелиальных клеток, распластывание моноцитов в условиях потока
сдвига и трансмиграцию. Таким образом, ЛПВП и apoA-I проявляют
противовоспалительный эффект на моноцитах человека, подавляя активацию CD11b. ApoA-I действует
через АВСА1, в то время как ЛПВП могут действовать через несколько рецепторов.
ВВЕДЕНИЕ
Уровень липопротеидов высокой плотности
(ЛПВП) в плазме крови обратно коррелирует с сердечно-сосудистой заболеваемостью и смертностью [1, 2]. Наиболее
полно изученной
функцией ЛПВП является обратный транспорт холестерина. Другие кардиопротективные функции включают антиоксидантные
свойства и способность
повышать биодоступность оксида азота (NO) [3, 4].
Совсем недавно
сообщалось о противовоспалительном действие ЛПВП, в частности, в эндотелии [5, 6]. Критическим событием в формировании
атеросклеротических бляшек является привлечение моноцитов в интиму, где они дифференцируются
в макрофаги и захватывают модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛПНП)
через скевенджер-рецептор с последующим образованием пенистых клеток [7]. Вовлечение моноцитов включает экспрессию молекул
адгезии как эндотелием, так и моноцитами. В
многоступенчатом каскаде адгезии имеет место первоначальное прикрепление
моноцита к эндотелию через селектины, экспрессируемые на эндотелиальных
клетках. Затем происходит устойчивая
адгезия посредством молекул адгезии сосудистых клеток - VCAM-1 и
внутриклеточных молекул адгезии - ICAM-1, взаимодействующих с молекулами
адгезии моноцитов, такими, как CD11b/CD18 (Mac-1, CR3) [8-10]. Сообщалось о подавлении индуцированной фактором
некроза опухоли (ФНО) экспрессии VCAM-1, ICAM-1 и Е-селектина в эндотелиальных
клетках, предварительно инкубированных с ЛПВП [11, 12]. Кроме того, описано подавление продукции
активных форм кислорода, инфильтрации нейтрофилов и моноцитарного хемоаттрактантного белка – MCP-1 [13, 14]. Было
показано, что вызванное ЛПВП ингибирование экспрессии Е-селектина на
человеческих эндотелиальные клетках опосредовано липополисахаридами [11], что предлагает участие скевенджер-рецептора
класса В-1 (SR-B1) и рецептора S1P3, активирующих эндотелиальную
синтетазу окиси азота (eNOS), производящую NO [3, 15,16]. Однако
эффекты in vivo являются сложными и могут быть опосредованы восстановленными ЛПВП (вЛПВП) или
обезлипиженным apoA-I [13,14]. В противоположность этому,результаты исследования,
полученные in vitro при
использовании эндотелиальных клеток, продемонстрировали противовоспалительные
эффекты ЛПВП при активации нейтрофилов, с одним важным исключением [17], когда было показано, что за противовоспалительные
эффекты отвечает апоА-I [18-21]. Примечательно, что ЛПВП также ингибируют
взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных
клеток, индуцированное окисленными ЛПНП (oxЛПНП), без индукции экспрессии эндотелиальных молекул
адгезии и без ослабления адгезии лейкоцитов путем блокирования эндотелиальных
молекул адгезии [22]. В этой статье мы рассмотрим механизм, посредством
которого ЛПВП и апоА-I предотвращают и изменяют
активацию лейкоцитов. Наши исследование показали, что ЛПВП и апоА-I действуют через различные рецепторы, уменьшая активацию моноцитов, и что
основным путем проявления активности апоА-I является моноцитарный ATP-связанный
кассетный транспортер А1 (ABCA1).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение моноцитов. Покоящиеся моноциты человека были выделены центрифугированием
в градиенте плотности как описано ранее [23].
Акцепторы холестерина. ЛПВП
были выделены из плазмы с помощью последовательных процедур ультрацентрифугирования
(плотность от 1,085 до 1.21 г/мл), после чего измеряли содержание белка.
Восстановленные ЛПВП (вЛПВП) [24,25] и липосомы фосфатидилхолина были приготовлены
как описано ранее [26]; все добавки ЛПВП осуществляли в концентрации 50 мкг /
мл, если не указано иное. АпоА-I был выделен из плазмы
крови человека как описано ранее [27] и использовался в концентрации 40 мкг/мл.
Бета-циклодекстрин и циклодекстрин, насыщенный холестерином, были приготовлены
как описано ранее [28]. Пептид L37pA был синтезирован как описано [29].
Блокировка рецепторов. Рецепторы
моноцитов были заблокированы с помощью специфических блокирующих антител в
течение 4 часов при 4°C.
Антимышиные IgM (Sigma) использовали в качестве контроля.
Проточная цитометрия. Моноциты стимулировали и инкубировали с антителами к
CD11b, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) в течение 15 минут при 37°C, если не указано
иное. Клетки фиксировали и экспрессию CD11b измеряли с помощью проточной
цитометрии. Образцы контролировали с помощью изотипного отрицательного
контроля. Результаты выражали как процент нестимулированного контроля (100%)
или PMA (100%, только для Танжера). Для количественного определения липидных
рафтов моноциты инкубировали в течение 15 минут при 37°С, центрифугировали и
инкубировали с FITC-меченым токсином холеры B (CT-B) в течение 1 часа при
комнатной температуре, затем рафты измеряли с помощью проточной цитометрии.
Окрашивание липидных рафтов. Рафты были окрашены
с использованием комплекта для мечения липидных рафтов Vybrant в соответствии с
инструкциями производителя. Моноциты помещали в флуоресценентную среду и
рассматривали на флуоресцентном микроскопе. Интенсивность окрашивания
определяли количественно с использованием Image Pro программного обеспечения.
Исследование перфузии. Исследование
перфузии проводилось с использованием параллельных проточных камер как описано
ранее [30]. Престимулированные моноциты подвергались перфузии через
эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (HCAECs) при сдвиге скорости
150 с-1 (1,1 дин / см2) в течение 5 минут с периодом
вымывания 5 минут. Адгезия моноцитов анализировалась в автономном режиме.
Определение
распластывания/адгезии моноцитов. Исследование перфузии проводили в
микрокапиллярной стеклянной трубке, покрытой тромбоцитами при температуре 37°C [31]. Предактивированные
моноциты перфузировали через тромбоцитарный монослой в течение 5 минут,
затем вымывали в течение 5 минут. Моноцит-тромбоцит взаимодействие было
визуализировано в соответствии с «исследованием перфузии».
Определение статической
адгезии. Адгезию моноцитов к иммобилизованному фибриногену проводили в
течение 15 минут при 37°С как описано ранее [31].
Определение миграции. Определение
миграции проводилось с использованием 8,0 ммоль/л Transwells [32]. Обработанные
моноциты сажали в верхнюю камеру и позволяли им мигрировать в течение 30 минут
при 37 ° C в нижнюю камеру, содержащую 50 нг/мл MCP-1. Мигрировавшие моноциты
были зафиксированы и определены как количество мигрировавших клеток.
Содержание филаментов актина. Моноциты окрашивали
на содержание F-актина 488-фаллоидином и определяли количественно с помощью
проточной цитометрии или проводили докрашивание DAPI и исследовали с помощью
конфокальной микроскопии.
Статистический анализ. Значения представлены
как среднее ± SEM или процент от контроля ± SEM. Все результаты были
проанализированы на статистическую значимость с
использованием одновариантного теста ANOVA с последующим тестом Бонферрони, за
исключением исследования перфузии, которая была проанализирована с использованием
двухвариантного теста ANOVA с последующим тестом Бонферрони. Значимыми
были приняты изменения при Р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
ЛПВП
подавляют PMA-индуцированную активацию CD11b. Активация
моноцитарного интегрина CD11b, индуцированная PMA, которая была дозозависимой,
ингибировалась ЛПВП (от 2 до 50 мкг / мл; Рисунок 1А). Хотя концентрации ЛПВП,
используемые в настоящем исследовании, были ниже уровня в плазме крови, они
приближаются к насыщающей концентрации,
описанной в экспериментах по оттоку холестерина, обычно используемой другими [33].
Снижение активированного CD11b сопровождалось уменьшением общего
количества CD11b (PMA против ЛПВП (50 мкг / мл) + PMA: 19±1,84 по сравнению с 9,7±1,89 U; n=4, P<0,001). Чтобы
оценить, насколько ответ на ЛПВП зависел от неоднородности моноцитов, были
выделены CD16+ и CD16- моноциты и сравнивался их ответ. Не было
обнаружено никакой разницы между двумя подфракциями в ответ на ЛПВП. АпоА-I снижает активацию CD11b. Восстановленные ЛПВП и апоА-I ингибировали CD11b
активацию до сопоставимой с ЛПВП степени (Рисунок 1В). В отличие от них, ни BSA, ни липосомы из
фосфатидилхолина не оказывали какого-либо воздействия (Рисунок 1А и 1В). ЛПВП и
апоА-I значительно снижали активацию CD11b, активированную как
липополисахаридом (ЛПС), так и fMLP. ЛПВП
предотвращают и изменяют активацию моноцитов. Предварительная
инкубация моноцитов с ЛПВП с последующей стимуляцией либо с PMA (Рисунок
1 С) или ЛПС (ЛПС против предотвращения; 152±1,8
против 101±4,5, n=5, P<0,01) привела к значительному сокращению экспрессии CD11b
(Рисунок 1C).
Кроме того, престимуляция моноцитов PMA с последующей 15-минутной
инкубацией с ЛПВП также значительно снижала экспрессию CD11b (Рисунок 1C),
то же наблюдалось с ЛПС (ЛПС против обратной
реакции; 152±1,8 против 92,8±5,7, n=5, P<0.01). Моноциты,
прединкубированные с ЛПВП или апоА-I, отмытые, а
затем стимулированные PMA (или FMLP, данные не представлены), также
продемонстрировали предотвращение активации
моноцитов (Рисунок 1D).
Рисунок 1. Активация CD11b: Моноциты стимулировали
(A) PMA
(1мкмоль / л) ± ЛПВП (2 - 50 мкг / мл) или BSA (50 мкг / мл) (B) PMA ± ЛПВП (50 мкг / мл), вЛПВП (40 мкг / мл), апоА-I (40 мкг / мл) или
липосомами POPC (10-50 мкг / мл) (C). Моноциты либо
предварительно инкубировали с ЛПВП (50 мкг / мл; 30 минут) перед добавлением
PMA (1 мкмоль / л; 15 минут "предотвращение") или предварительно
инкубировали с PMA (15 минут) перед добавлением ЛПВП (30 минут
"регрессия") и сравнивали с контролем (только PMA, окончательно 15
минут). (D) Моноциты были предварительно
инкубированы с ЛПВП (50 мкг / мл) или апоА-I (40 мкг / мл) в течение 30
минут до удаления с помощью центрифугирования, моноцитов промывали PBS.
Моноциты затем стимулировали либо PMA (15 минут) и уровень CD11b оценивали с
помощью проточной цитометрии. Результаты выражали в процентах от активации по
сравнению с контролем (нестимулированные моноциты). * P <0,05, ** P
<0,01, *** Р <0,001.
Регуляция экспрессии CD11b и
оттока холестерина. Циклодекстрин значительно ослаблял
PMA-индуцированную активацию CD11b (Рисунок 2А). Холестерин-насыщенный
циклодекстрин (Ch-CD) не влиял на PMA-индуцированную активацию CD11b
(Рисунок 2А).
Рисунок 2. Отток холестерина: (А)
Моноциты инкубировали с PMA (1 мкмоль / л) ± циклодекстрин или
циклодекстрин, насыщенный холестерином (100-200 мкг / мл) в течение 15 минут и
определяли активацию CD11b. * P <0,05, ** P
<0,01, *** Р <0,001. CD = циклодекстрин, CD-CH = циклодекстрин, насыщенный холестерином. (B) Моноциты
инкубировали с апоА-I (40 мкг / мл), ЛПВП (50 мкг / мл), CD (200 мкг / мл),
липосомами (50 мкг / мл) и BSA (50 мкг / мл) в течение 15 мин, липидные рафты
окрашивали CT-B и клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. (C)
Конфокальная микроскопия моноцитов, окрашенных CT-B без (вверху) и с обработкой апоА-I (40 мкг / мл) в течение 15 минут (бар
= 2 мкм).
Изменения количества
липидных рафтов. Обработка моноцитов апоА-I, ЛПВП и CD, но не липосомами или
BSA, значительно снижала количество липидных рафтов плазмалеммы (Рисунок 2 B). Инкубация с апоА-I резко изменяла количество мембранных
рафтов (контроль по сравнению апоА-I; 66,9±11,3 относительных единиц
флуоресценции [ОЕФ] в сравнении с 37,3±4,6 ОЕФ, n=5, P<0.05; представлено
визуально на Рисунке 2C),
что свидетельствует о быстром оттоке рафтов из плазматической мембраны.
Участие SR-B1. Блокировка SR-B1
притупляла эффект ЛПВП на активацию CD11b, хотя и незначительно (P=0,18;
Рисунок 3А). Блокада SR-B1 не влияла на подавление активации CD11b,
индуцированной апоА-I (Рисунок 3А). Контрольные антитела не имели эффекта.
Участие ABCA1. Противовоспалительные
эффекты апоА-I, но не ЛПВП (Рисунок 3B) были отменены в присутствии ABCA1,
блокированного антителами NDF4C2. Контрольные антитела не имели эффекта. Роль
интернализации ABCA1 была выявлена при использовании антител NDF6F1 [34], которые не затрагивают
ABCA1-зависимый отток холестерина, но предотвращает интернализацию ABCA1 и его деградацию.
NDF6F1 не влияли на ингибирующее действие апоА-I на PMA-индуцированную
экспрессию CD11b (Рисунок 3C).
Рисунок 3. Исследования с блокировкой: (А) Моноциты инкубировали с
антителами, блокирующими SR-B1 (4 часа), затем были обработаны PMA (1 мкмоль /
л) ± апоА-I (40 мкг / мл) или ЛПВП (50 мкг / мл) в течение 15 минут. * P
<0,05, ** P <0,01 n = 4. анти-SR-B1 =
блокирование анти-SR-B1. cAb = контрольные антитела. (BC) Моноциты
инкубировали с NDF4C2 анти-ABCA1 антителами. * P <0,05, ** P <0,01 c.f. PMA, # Р <0,05 c.f. apoA-I/PMA.
Адгезия моноцитов к
эндотелиальным клеткам при сдвиге потока. По сравнению с
нестимулированными моноцитами, PMA значительно повышал адгезию моноцитов к
эндотелиальным клеткам. Инкубация моноцитов с PMA и ЛПВП или апоА-I приводила к
значительному снижению адгезии моноцитов (Рисунки 4А и 4D). Важность
взаимодействия между апоА-I и ABCA1 была также изучена при сдвиге потока. В
присутствии антител к ABCA1 значительное снижение адгезии, индуцированной
апоА-I, не проявлялось (Рисунок 4E). NDF4C2 или контрольные антитела не влияли
на адгезию (данные не представлены).
Рисунок 4. Адгезия моноцитов сцепления при сдвиге потока: Моноциты
были предварительно обработаны PMA (1 мкмоль / л) или PMA + ЛПВП (50 мкг / мл)
или PMA + апоА-I (40 мкг / мл) в течение 15 минут до перфузии поверх эндотелия.
(А) Число прикрепившихся моноцитов подсчитывали и наносили на график как среднее
число клеток на поле ± SEM. * P <0,05, *** Р <0,001 PMA против ЛПВП /
PMA, # Р <0,05, # # # Р <0,001 PMA против apoA-I/PMA. (BD)
Фазово-контрастные фотографии моноцитов, прикрепленных к конфлюентному монослою
эндотелия после 5 мин в сдвиге потоков; (B) PMA, (C) ЛПВП + PMA и апоА-I + PMA
(D). Увеличение X200, Бар = 56 мкм. (E) Моноциты были предварительно обработаны
в течение 4 часов ± ABCA1 блокировкой антителами NDF4C2. Разблокированные
моноциты обрабатывали PMA (1 мкмоль / л) или PMA + апоА-I (40 мкг / мл), ABCA1
блокированные моноциты обрабатывали PMA + апоА-I в течение 15 минут при 37° С и
перфузировали поверх эндотелия. Результаты были проанализированы и выражались,
как в (А). *** Р <0,001 PMA против apoA-I/PMA.
Распластывание и адгезия
моноцитов на тромбоцитах при сдвиге потока. Чтобы изучить влияние
ЛПВП на распластывание моноцитов при сдвиге потока, моноциты, стимулированные
PMA, перфузировали над тромбоцитарным монослоем в течение 5 минут (t=0 секунд),
с последующим 5-минутный периодом отмывания (t=300 секунд, с или без ЛПВП). До
отмывания не было разницы между 2 группами в распластывании клеток. Промывка
стимулированных моноцитов ЛПВП-содержащим буфером приводила к значительному
снижению в распластывания по сравнению с промывкой одним буфером (Рисунок 5А).
Значительное снижение адгезии моноцитов к тромбоцитам наблюдалось и после
промывки с ЛПВП по сравнению с одним буфером.
Трансмиграция моноцитов. MCP-1 способствовал
существенному миграционному ответу моноцитов, который был заметно снижен, когда
моноциты предварительно инкубировали с ЛПВП или апоА-I (Рисунок 5В).
Содержание F-актина в
моноцитах. Стимуляция моноцитов PMA приводила к увеличению уровня F-актина,
который был значительно снижен при инкубации с ЛПВП и PMA (Рисунок 5С). Это
наблюдение было подтверждено проточной цитометрией (P<0.01; Рисунок 5D).
Рисунок 5. Фенотип моноцитов: (A) Моноциты были
предварительно стимулированы PMA (15 минут) и подвергались перфузии поверх
монослоя тромбоцитов в течение 5 мин (0 сек) после 5 минут (300 сек) промывания
с буфером (белые кружки) или ЛПВП (50 мкг / мл) (черные кружки). (B)
Трансмиграция моноцитов. Моноциты (± обработка) были посажены в верхнюю камеру
Transwell и мигрировали к MCP-1 (50 нг / мл). Мигрирующие моноциты определяли
количественно с использованием фазовой микроскопии (X40). * P <0,05. (C)
Конфокальная микроскопия нестимулированных или обработанных PMA (1 мкмоль / л)
± ЛПВП (50 мкг / мл). F-актин окрашивали Alexa Fluor 488 фаллоидином (зеленый)
и ядерным красителем DAPI (синий). Бар = 6,8 мкм. (D) Содержание F-актина
измеряли с использованием фаллоидина. Моноциты обрабатывали PMA (1 мкмоль / л) ± ЛПВП (50 мкг / мл) ** P <0,01.
Рисунок 6. Моноциты больного
болезнью Танжера: (A) Моноциты стимулировали
PMA ± апоА-I (40 мкг /мл) или ЛПВП (50 мкг / мл). Активацию
CD11b количественно оценивали с помощью проточной цитометрии. (B)
Изолированные моноциты обрабатывали PMA ± апоА-I (40 мкг / мл) или ЛПВП (50 мкг
/ мл) и сажали на покровные стекла, покрытые
фибриногеном. Прикрепленные моноциты подсчитывали
на пяти случайных полях с помощью фазовой микроскопии (X40). Белый столбик -
здоровые, серый столбик - гетеро, черный столбик - Танжер.
L37pA ингибирует активацию
моноцитов подобно апоА-I. Миметический пептид L37pA [29] (10 и 20
мкг / мл) значительно уменьшал стимулированную PMA экспрессию CD11b на
моноцитах, а также стимулированную PMA адгезию моноцитов на покрытом
фибриногеном покровном стекле в статических условиях.
Моноциты больного болезнью
Танжера. Для облегчения сравнения между членами семьи R1068H больных
болезнью Танжера, результаты выражались в процентах от экспрессии CD11b после
активации с PMA. Моноциты, выделенные из крови здоровых родственников,
обработанные PMA и апоА-I или ЛПВП, продемонстрировали такое же снижение, как и
в предыдущих анализах (Рисунок 6А). Моноциты гетерозигот имели сниженную
способность реагировать на апоА-I, однако при этом наблюдалось еще и снижение активации CD11b.
Моноциты, взятые у пациента с болезнью Танжера, не реагировали на воздействие
апоА-I. ЛПВП снижали активацию CD11b как в
моноцитах гетерозигот и моноцитах больного болезнью Танжера, хотя не
было выявлено ген-дозозависимый ответа на апоА-I (Рисунок
6А). Сходные результаты были получены при
оценке способности как апоА-I, так и ЛПВП снижать адгезию моноцитов к
фибриногену (Рисунок 6В).
ОБСУЖДЕНИЕ
Активация моноцитов является ключевым событием в
воспалении и атеросклерозе, имеющем место в сосудистой стенке. В данном исследовании
мы показали, что ЛПВП и апоА-I могут предотвратить, а также вызвать процесс,
обратный активации моноцитов человека под воздействием апоА-I, оказывающего
свое действие через ABCA1. Основным результатом
данной статьи является то, что ЛПВП дозозависимо снижают экспрессию CD11b
на первичных моноцитах человека, стимулированных PMA. Этот эффект был также
обнаружен при использовании рецептор-опосредованных активаторов, таких, как ЛПС
и fMLP [23, 35,36]. Как ЛПВП, так и обезлипиженный апоА-I ингибируют
PMA-индуцированную активацию CD11b, однако фосфолипидные липосомы или альбумин
таким эффектом не обладали. Это соответствует результатам предыдущих исследований, в которых было показано, что
апоА-I ингибирует распластывание моноцитов в ответ на
колониестимулирующий фактор M (CSF) [21]. Интересно, что механизм,
посредством которого ЛПВП и апоА-I подавляют активацию моноцитов, как
представляется, отличается от противовоспалительного действия этих молекул на эндотелиальные клетки, относительно
которого предполагается, что оно опосредовано ЛПВП-стимуляцией продукции NO [11, 16, 37]. Отток
холестерина, как представляется – это необходимое условие для проявления
эффектов апоА-I и ЛПВП, поскольку циклодекстрин эффективно имитирует ЛПВП и апоА-I в ингибировании активации CD11b на
моноцитах. Хотя циклодекстрин удаляет холестерин неспецифически [38], он
удаляет его из того же пула плазматической мембраны, что и апоА-I, о чем
свидетельствует повышение оттока на циклодекстрин после оверэкспрессии ABCA1 [39].
Нагрузка циклодекстрина холестерином, которая преобразует циклодекстрин в донор холестерина, делает его неактивным, тем самым
подтверждая, что для проявления активности необходим отток холестерина.
Примечательно, что удаление
циклодекстрина и холестерина, как было показано,
препятствует распластыванию моноцитов, когда они инкубируются с М-CSF [21] и
приводит к быстрому втягиванию выступов мембраны макрофагов [40]. Далее мы
показали, что короткая инкубация с апоА-I, ЛПВП и CD, но не с липосомами или
BSA, приводит к истощению холестерина рафтов. Вполне возможно, что последние не
влияют на процесс так сильно, как первая группа акцепторов холестерина.
Несмотря на это, вышеупомянутые результаты показывают, что быстрый отток
липидов клеточных мембран, по-видимому, является ключевым механизмом, влияющим
на воспалительные реакции моноцитов/макрофагов.
Чтобы изучить конкретные механизмы, связанные с эффектами ЛПВП на
активацию моноцитов и отток холестерина, мы исследовали участие двух рецепторов
ЛПВП - SR-B1 и ABCA1. SR-B1, наряду с ABCG1, как было показано, способствуют оттоку холестерина на ЛПВП, в то время как
обезлипиженый апоА-I удаляет холестерин исключительно через ABCA1-зависимый
путь [41]. Блокировка SR-B1 приводит к снижению, но не устранению
противовоспалительного действия ЛПВП, однако это не затрагивает апоА-I.
Блокировка ABCA1 полностью устраняет ингибирующее действие апоА-I, но не влияет
на ЛПВП. Таким образом, apoA-1/ABCA1 взаимодействие, вероятно, является
основным путем, опосредующим эти эффекты. Что касается других путей, таких, как SR-B1 и ABCG1, то
они также вносят вклад в эффекты ЛПВП.
Для изучения функциональных последствий снижения активации
моноцитов под воздействием ЛПВП был использован анализ адгезии в потоке сдвига.
В присутствии ЛПВП или апоА-I PMA-стимулированная адгезия
моноцитов к эндотелию была значительно ослаблена. Кроме того, блокирование
моноцитов ABCA1 вызывает реверсию apoAI-индуцированного снижения адгезии, в
соответствии с результатами анализа активации CD11b, и подтверждает участие ABCA1.
Хотя ранее уже было показано, что ЛПВП могут подавлять
распластывание моноцитов [21], наша работа - это первое исследование, описывающее этот эффект в физиологических условиях
сдвига потока. Ингибирование каскада клеточной адгезии под воздействием ЛПВП
было исследовано путем изучения
эффектов ЛПВП и апоА-I на миграцию моноцитов к MCP-1. Как ЛПВП, так и апоА-I
существенно подавляли миграцию моноцитов к MCP-1,
и эти результаты согласуются с наблюдениями Navab et al. [42]. Поскольку изменения цитоскелета
являются необходимым условием, чтобы вызвать распластывание и миграцию клеток,
которые, как было показано, связаны с увеличением
содержания F-актина [43], был количественно оценен общий F-актин и показано его
уменьшение в присутствии ЛПВП. Эти данные согласуются с уменьшением в распластывания, полученные Diederich et al. [21].
Ингибирующий эффект ЛПВП на моноцитах может
приводить как к профилактике, так и к регрессии. Это, в частности,
имеет важные последствия для болезненных состояний, таких, как острый коронарный синдром, где процесс воспаления
уже произошел. В своей работе мы ясно продемонстрировали, что
предстимулированные моноциты могут быть защищены от активации ЛПВП. Это может
объяснить также результаты предыдущих исследований, продемонстрировавших, что
ЛПВП / апоА-I могут уменьшить активацию эндотелия и нейтрофилов, скапливающихся
в интиме-медии в воспалительной модели in vivo до 9 часов после
стимуляции воспаления [14]. Наши данные также согласуются с исследованиями на животных, в которых в краткосрочное повышение ЛПВП было
атеропротективным [44].
Недавнее прекращение клинических испытаний ингибирования CETP (белка-переносчика эфиров холестерина) предполагает,
что для повышения уровня ЛПВП нужны различные
стратегии [45]. Разработка имитаторов апоА-I
может обеспечить эффективную альтернативу. Ранее было показано, что
L37pA эффективно стимулирует отток холестерина и стабилизирует ABCA1 через те
же механизмы, что и апоА-I [29, 46, 47].
В наших исследованиях L37pA имитировал
противовоспалительное действие апоА-I на моноцитах, что указывает на
потенциал этого пептида для терапии при воспалительных заболеваниях.
Наконец, мы исследовали противовоспалительную роль ЛПВП и апоА-I
при болезни Танжера на гетерозиготном больном и здоровых членах семьи R1068H [48].
У больных болезнью Танжера имеются дисфункции ABCA1, из-за которых белок не в
состоянии обеспечивать отток холестерина на апоА-I [49]. Ответ моноцитов
здоровых членов семьи был похож на ответы
практически здоровых лиц; моноциты гетерозиготного больного отвечали на ЛПВП и
апоА-I в меньшей степени по сравнению с моноцитами здоровых членов
семьи. Напротив, апоА-I не уменьшал активацию
CD11b моноцитов пациента с болезнью Танжера, хотя ЛПВП продолжали ее
ингибировать. Аналогичные эффекты наблюдались при
исследовании адгезии к фибриногену моноцитов пациента, больного болезнью
Танжера. Эти данные согласуются с нашей гипотезой о том, что апоА-I действует
через ABCA1, чтобы ингибировать активацию моноцитов, тогда как ЛПВП
дополнительно подключаются через ABCA1-независимый путь.
Таким образом, в данном исследовании впервые подробно изучен
механизм, посредством которого ЛПВП и апоА-I регулируют адгезию моноцитов, их
распластывание и активацию интегрина. Тот факт, что апоА-I сравним по силе
эффектов с ЛПВП в подавлении элементов воспаления, позволяет лучше представить
себе новые стратегии в терапии, такие, например, как апоА-I-имитирующие пептиды
в лечении и предотвращении атеросклероза [50]. Данные о том, что ЛПВП могут влиять на воспалительные статус моноцитов
у пациентов с болезнью Танжера, указывают на возможность применения терапевтических стратегий с использованием ЛПВП. Они
могут быть использованы для пациентов, которые подвергаются риску
сердечно-сосудистых заболеваний. Способность
ЛПВП предотвращать и вызывать регрессию активации моноцитов может также иметь
значительный интерес для разработки терапии различных воспалительных
заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Castelli, W.P., Garrison, R.J., Wilson, P.W., et al. Incidence of coronary
heart disease and lipoprotein cholesterol levels. The Framingham Study. // JAMA.
- 1986. - Vol. 256. - P. 2835–2838.
2.
Gordon, T., Castelli, W.P., Hjortland, M.C., et al. High density lipoprotein as
a protective factor against coronary heart disease. The Framingham Study. //
Am. J. Med. - 1977. - Vol. 62. - P. 707–714.
3.
Nofer, J.R,, van der Giet, M., Tolle, M., et al. HDL induces NO-dependent
vasorelaxation via the lysophospholipid receptor S1P3. // J. Clin. Invest. -
2004. - Vol. 113. - P. 569 –581.
4.
Watson, A.D., Berliner, J.A., Hama, S.Y., et al. Protective effect of high density
lipoprotein associated paraoxonase. Inhibition of the biological activity of
minimally oxidized low density lipoprotein. // J. Clin. Invest. - 1995. -
Vol. 96. - P. 2882–2891.
5. Barter,
P.J., Nicholls, S., Rye, K.A., et al. Antiinflammatory properties of HDL.
// Circ. Res. - 2004. - Vol. 95. - P. 764–772.
6.
Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. // Nature. - 2002. - Vol. 420. - P.
868–874.
7.
Rahaman, S.O., Lennon, D.J., Febbraio, M., et al. A CD36-dependent signaling
cascade is necessary for macrophage foam cell formation. // Cell. Metab. -
2006. - Vol. 4. - P. 211–221.
8.
Diamond, M.S., Staunton, D.E., de Fougerolles, A.R., et al. ICAM-1 (CD54): a
counter-receptor for Mac-1 (CD11b/CD18). // J. Cell. Biol. - 1990. - Vol. 111.
- P. 3129 –3139.
9. Diamond,
M.S., Staunton, D.E., Marlin, S.D., Springer, T.A. Binding of the integrin
Mac-1 (CD11b/CD18) to the third immunoglobulin-like domain
of
ICAM-1 (CD54) and its regulation by glycosylation. // Cell. - 1991. - Vol. 65.
- P. 961–971.
10.
Springer, T.A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration:
the multistep paradigm. // Cell. - 1994. - Vol. 76. - P. 301–314.
11. Nofer,
J.R., Geigenmuller, S., Gopfert, C., et al. High density
lipoprotein-associated lysosphingolipids reduce E-selectin expression in human
endothelial cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2003. - Vol. 310. - P.
98 –103.
12.
Cockerill, G.W., Rye, K.A., Gamble, J.R., et al. High-density
lipoproteins
inhibit cytokine-induced expression of endothelial cell
adhesion
molecules. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1995. - Vol. 15. - P.
1987–1994.
13.
Nicholls, S.J., Dusting, G.J., Cutri, B., et al. Reconstituted high-density
lipoproteins inhibit the acute pro-oxidant and proinflammatory vascular changes
induced by a periarterial collar in normocholesterolemic rabbits. //
Circulation. - 2005. - Vol. 111. - P. 1543–1550.
14.
Puranik, R., Bao, S., Nobecourt, E., et al. Low dose apolipoprotein A-I rescues
carotid arteries from inflammation in vivo. // Atherosclerosis. - 2008. - Vol.
196. - P. 240 –247.
15.
Yuhanna, I.S., Zhu, Y., Cox, B.E., et al. High-density lipoprotein binding to
scavenger receptor-BI activates endothelial nitric oxide synthase. // Nat. Med.
- 2001. - Vol. 7. - P. 853– 857.
16. Kimura,
T., Tomura, H., Mogi, C., et al. Sphingosine 1-phosphate receptors mediate
stimulatory and inhibitory signalings for expression of adhesion molecules in
endothelial cells. // Cell. Signal. - 2006. - Vol. 18. - P. 841– 850.
17.
Moudry, R., Spycher, M.O., Doran, J.E. Reconstituted high density lipoprotein
modulates adherence of polymorphonuclear leukocytes to human
endothelial cells. // Shock. - 1997. - Vol. 7. - P. 175–181.
18.
Kopprasch, S., Pietzsch, J., Graessler, J. The protective effects of HDL and its
constituents against neutrophil respiratory burst activation by hypochlorite-oxidized
LDL. // Mol. Cell. Biochem. - 2004. - Vol. 258. - P. 121–127.
19.
Blackburn, W.D., Jr., Dohlman, J.G., Venkatachalapathi, Y.V., et al.
Apolipoprotein A-I decreases neutrophil degranulation and superoxide
production. // J. Lipid. Res. - 1991. - Vol. 32. - P. 1911–1918.
20.
Liao, X.L., Lou, B., Ma, J., Wu, M.P. Neutrophils activation can be diminished by
apolipoprotein A-I. // Life. Sci. - 2005. - Vol. 77. - P. 325–335.
21.
Diederich, W., Orso, E., Drobnik, W., Schmitz, G. Apolipoprotein AI and HDL(3)
inhibit spreading of primary human monocytes through a
mechanism
that involves cholesterol depletion and regulation of CDC42. //
Atherosclerosis. - 2001. - Vol. 159. - P. 313–324.
22. Maier,
J.A., Barenghi, L., Pagani, F., et al. The protective
role of high-density lipoprotein on oxidized-low-densitylipoprotein-induced
U937/endothelial cell interactions. // Eur. J. Biochem. - 1994. - Vol. 221. -
P. 35– 41.
23.
Woollard, K.J., Phillips, D.C., Griffiths, H.R. Direct modulatory effect of C-reactive
protein on primary human monocyte adhesion to human endothelial cells.
// Clin. Exp. Immunol. - 2002. - Vol. 130. - P. 256 –262.
24.
Matz, C.E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines
and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. // J. Biol.
Chem. - 1982. - Vol. 257. - P. 4535– 4540.
25.
Jonas, A., Kezdy, K.E., Wald, J.H. Defined apolipoprotein A-I conformations in
reconstituted high density lipoprotein discs. // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol.
264. - P. 4818–4824.
26.
Sviridov, D., Fidge, N. Efflux of intracellular versus plasma membrane cholesterol
in HepG2 cells: different availability and regulation by apolipoprotein A-I. //
J. Lipid. Res. - 1995. - Vol. 36. - P. 1887–1896.
27.
Morrison, J.R., Fidge, N.H., Grego, B. Studies on the formation, separation, and
characterization of cyanogen bromide fragments of human AI apolipoprotein. //
Anal. Biochem. - 1990. - Vol. 186. - P. 145–152.
28.
Christian, A.E., Haynes, M.P., Phillips, M.C., Rothblat, G.H. Use of
cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. // J. Lipid. Res.
- 1997. - Vol. 38. - P. 2264 –2272.
29.
Remaley, A.T., Thomas, F., Stonik, J.A., et al. Synthetic amphipathic helical peptides
promote lipid efflux from cells by an ABCA1-dependent and an ABCA1-
independent
pathway. // J. Lipid. Res. - 2003. - Vol. 44. - P. 828–836.
30.
Lawrence, M.B., McIntire, L.V., Eskin, S.G. Effect of flow on polymorphonuclear
leukocyte/endothelial cell adhesion. // Blood. - 1987. - Vol. 70. - P.
1284–1290.
31. Woollard,
K.J., Kling, D., Kulkarni, S., et al. Raised plasma soluble P-selectin in
peripheral arterial occlusive disease enhances leukocyte adhesion. // Circ.
Res. - 2006. - Vol. 98. - P. 149 –156.
32.
Leavesley, D.I., Schwartz, M.A., Rosenfeld, M., Cheresh, D.A. Integrin beta 1- and
beta 3-mediated endothelial cell migration is triggered through distinct
signaling mechanisms. // J. Cell. Biol. - 1993. - Vol. 121. - P. 163–170.
33.
Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates
the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol- rich
domains (caveolae). // Biochem. J. - 2001. - Vol. 358. - P. 79–86.
34.
Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A.T., Sviridov, D. The role of
different regions of ATP-binding cassette transporter A1 in cholesterol efflux.
// Biochemistry. - 2007. - Vol. 46. - P. 9388 –9398.
35.
Lynn, W.A., Raetz, C.R., Qureshi, N., Golenbock, D.T. Lipopolysaccharideinduced
stimulation of CD11b/CD18 expression on neutrophils. Evidence of specific
receptor-based response and inhibition by lipid A-based antagonists. // J.
Immunol. - 1991. - Vol. 147. - P. 3072–3079.
36. Badolato,
R., Sozzani, S., Malacarne, F., et al. Monocytes from Wiskott-Aldrich
patients display reduced chemotaxis and lack of cell
polarization in response to monocyte chemoattractant protein-1 and
formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine. // J. Immunol. - 1998. - Vol. 161. - P. 1026
–1033.
37.
Wadham, C., Albanese, N., Roberts, J., et al. High-density lipoproteins
neutralize C-reactive protein proinflammatory activity. // Circulation. - 2004.
- Vol. 109. - P. 2116–2122.
38.
Kilsdonk, E.P., Yancey, P.G., Stoudt, G.W., et al. Cellular cholesterol efflux
mediated by cyclodextrins. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 17250
–17256.
39. Nagao,
K., Takahashi, K., Hanada, K., et al. Enhanced apoA-I-dependent
cholesterol efflux by ABCA1 from sphingomyelin-deficient Chinese hamster ovary
cells. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - P. 14868 –14874.
40. Gaus, K.,
Kritharides, L., Schmitz, G., et al. Apolipoprotein A-1 interaction with
plasma membrane lipid rafts controls cholesterol export from macrophages. //
FASEB. J. - 2004. - Vol. 18. - P. 574 –576.
41. Duong,
M., Collins, H.L., Jin, W., et al. Relative contributions of ABCA1 and SR-BI to
cholesterol efflux to serum from fibroblasts and macrophages. // Arterioscler.
Thromb. Vasc. Biol. - 2006. - Vol. 26. - P. 541–547.
42.
Navab, M., Imes, S.S., Hama, S.Y., et al. Monocyte transmigration induced
by modification of low density lipoprotein in cocultures of human
aortic wall cells is due to induction of monocyte chemotactic protein
1 synthesis and is abolished by high density lipoprotein. // J. Clin. Invest. -
1991. - Vol. 88. - P. 2039 –2046.
43. Capo, C.,
Meconi, S., Sanguedolce, M.V., et al. Effect of cytotoxic necrotizing
factor-1 on actin cytoskeleton in human monocytes: role in the regulation of
integrin-dependent phagocytosis. // J. Immunol. - 1998. - Vol. 161. - P. 4301–
4308.
44. Palazon,
C.P., Alfon, J., Gaffney, P., et al. Effects of reducing LDL and
increasing HDL with gemfibrozil in experimental coronary lesion development and
thrombotic risk. // Atherosclerosis. - 1998. - Vol. 136. - P. 333–345.
45.
Kastelein, J.J., van Leuven, S.I., Burgess, L., et al. Effect of
torcetrapib on carotid atherosclerosis in familial hypercholesterolemia. // N.
Engl. J. Med. - 2007. - Vol. 356. - P. 1620 –1630.
46.
Arakawa, R., Hayashi, M., Remaley, A.T., et al. Phosphorylation and
stabilization of ATP binding cassette transporter A1 by synthetic amphiphilic
helical peptides. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 6217– 6220.
47.
Tang, C., Vaughan, A.M., Anantharamaiah, G.M., Oram, J.F. Janus kinase 2 modulates
the lipid-removing but not protein-stabilizing interactions of amphipathic
helices with ABCA1. // J. Lipid. Res. - 2006. - Vol. 47. - P. 107–114.
48.
Slatter, T.L., Williams, M.J., Frikke-Schmidt, R., et al. Promoter haplotype of
a new ABCA1 mutant influences expression of familial hypoalphalipoproteinemia. //
Atherosclerosis. - 2006. - Vol. 187. - P. 393– 400.
49.
Remaley, A.T., Schumacher, U.K., Stonik, J.A., et al. Decreased reverse
cholesterol transport from Tangier disease fibroblasts. Acceptor specificity and
effect of brefeldin on lipid efflux. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. -
1997. - Vol. 17. - P. 1813–1821.
50.
Sethi, A.A., Amar, M., Shamburek, R.D., Remaley, A.T. Apolipoprotein AI mimetic
peptides: possible new agents for the treatment of atherosclerosis. // Curr.
Opin. Investig. Drugs. - 2007. - Vol. 8. - P. 201–212.
Работа была поддержана Министерством образования
и науки Российской Федерации.
|
