Авторы: А.В. Желанкин ⁽¹⁾, М.А. Сазонова ^(1,3), Г.А. Коробов ⁽²⁾, З.Б.Хасанова⁽³⁾, А.Ю. Постнов⁽³⁾, А.Н. Орехов ^(1,2), И.А. Собенин ^(1,2,3)

¹Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук (г. Москва);

²Научно-исследовательский институт атеросклероза Российской академии естественных наук (г. Москва);

³ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России (г. Москва).

Резюме

Проведена детекция митохондриальной замены T на C в позиции 3336 при атеросклеротических поражениях человека. Полученные результаты показывают различия в значениях процента гетероплазмии митохондриальной мутации T3336C между тканями здоровых участков аорты и участков с атеросклеротическими поражениями.

Введение

Атеросклеротическое поражение стенок сосудов является фактором риска развития многих сердечно-сосудистых заболеваний. Такие заболевания, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт, инсульт и артериальная гипертония имеют высокую социальную значимость вследствие весомого вклада в структуру инвалидизации и смертности мирового населения. Таким образом, большое значение имеет ранняя диагностика и своевременная профилактика атеросклероза с целью предотвращения его ярких клинических проявлений и осложнений. Одним из способов ранней, досимптоматической диагностики атеросклероза является выявление генетической предрасположенности индивидов к его развитию. Изменения в некоторых генах, называемых «генами предрасположенности», в совокупности с неблагоприятными условиями внешней среды, могут привести к развитию атеросклеротических поражений стенок сосудов и сопутствующих заболеваний [1-4] .

Важным фактором генетической предрасположенности к атеросклерозу являются изменения в структуре митохондриального генома. Митохондриальные мутации ассоциируются с различными заболеваниями, часто встречающимися в сочетании с атеросклеротическими поражениями, такими как стеноз коронарных сосудов, некоторые формы сахарного диабета и глухоты, инфаркт миокарда, кардиомиопатия. Нестабильноссть и высокая мутабельность митохондриального генома является причиной возникновения прижизненных соматических мутаций в митохондриальной ДНК и существования гетероплазмии (наличия в клетке нормальных и мутантных молекул ДНК) [5-23].

 При изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями людей необходима не только качественная (наличие/отсутствие мутации), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии) [5, 7, 12, 23].

Настоящая работа является пилотным исследованием различий в величинах процента гетероплазмии митохондриальных мутаций в интимальной ткани при атеросклерозе. В работе проведена детекция замены T на C в позиции  3336 митохондриального генома человека в выборке образцов ДНК, выделенных из нормальных и пораженных атеросклерозом участков интимы аорт людей. Мутация локализована в кодирующей области митохондриального генома, в частности, в гене субъединицы 1 фермента дыхательной цепи NADH- дегидрогеназы.

Материалы и методы

Материалом исследования служили образцы ткани из интимы аорты, печени и мышцы лиц, погибших в результате несчастного случая или внезапной смерти. Для исследования было взято 7 аорт.

Выделение ДНК  

Митохондриальную ДНК выделяли из образцов с помощью набора AQUAPURE GENOMIC TISSUE KIT фирмы BioRad, следуя соответствующим протоколам. Визуализацию результатов выделения ДНК проводили с помощью электрофореза в горизонтальном аппарате в 0,8% агарозном геле.

ПЦР

При амплификации фрагмента размером 294 п.н., содержащего область мутации T3336C, использовали следующие праймеры:

1.Прямой праймер bio-AGGACAAGAGAAATAAGGCC;

2. Обратный праймер ACGTTGGGGCCTTTGCGTAG.

Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 0,4 - 0,6 мкг митохондриальной ДНК; 16,6 мкМ (NH₄)₂SO₄; 0,3 пкМ каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 67 мМ трис/HCl ( pH 8,8 ), 2,5 mM MgCl₂ и 3 ед. Taq-полимеразы.

Режим ПЦР: денатурация ДНК при 94⁰ C в течение трех минут, затем:

94⁰ C – 30 сек., 56⁰ C – 30 сек., 72⁰ C – 1 мин., всего – 35 циклов, с заключительным синтезом при 72⁰ C в течение 7 мин.

Детекцию продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в горизонтальном аппарате в 1,5% агарозном геле.

Пиросеквенирование

После проведения ПЦР было проведено пиросеквенирование амплификатов для выявления замены T на C в гене субъединицы 1 NADH- дегидрогеназы в позиции 3336 митохондриального генома человека. Исследования проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQ^TMHS96MA. При постановке эксперимента была использована схема приготовления проб, описанная в прилагающемся к пиросеквенатору методическом пособии [24, 25].

Последовательность праймера для пиросеквенирования была следующей:

TGCGATTAGAATGGGTAC (3354 - 3337).

Визуализация результатов осуществлялась на основе программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора, с помощью метода, разработанного авторами. Расчет величины процента гетероплазмии по мутации T3336C проводился на основе пиков, соответствующих интенсивностям люминисценции при последовательном встраивании различных нуклеотидов в цепь фрагмента, и отображаемых на пирограмме.

Результаты и обсуждение

Для подсчета процента гетероплазмии по данным пирограммы используется ранее разработанная авторами формула:

где P – процент гетероплазмии,

h –высота пика исследуемого нуклеотида,

N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей,

M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.

Мутацию T3336C (при использовании реверсного праймера для сиквенса – A3336G) можно определить по пикам нуклеотидов G и A, располагающимися в анализируемой последовательности под номерами 2 и 3 соответственно. По данным компьютерной программы, при 100% нормальных геномов (A/A) пик G2 отсутствует (0 единиц), а пик А3 составляет 2 единицы, (рис.1, а), а при 100% геномов с мутацией (G/G) пики G2 и А3 составляют по 1 единице (рис.1, б). Таким образом, сумма величин пиков A3 и G2 всегда составляет 2 единицы, и формула для расчета процента гетероплазмии для данной мутации выглядит следующим образом:

Например, согласно данной формуле, процент гетероплазмии по мутации T3336C в образце ДНК, взятом из стенки сосуда 86-летней женщины, оказался равен 90% (рис 1, в).

Для 29% (2 из 7) исследованных аорт были обнаружено, что значения процента гетероплазмии по мутации T3336C в липофиброзных бляшках значительно ниже по сравнению с нормальной сосудистой тканью. В контрольных образцах из печени и мышцы процент гетероплазмии по данным мутациям также оказался существенно ниже, чем в участках пораженной атеросклерозом интимы аорты.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.

Заключение. 

Полученные в ходе данного исследования результаты показывают значительные различия между значениями процента гетероплазмии по митохондриальной мутации T3336C между нормальными участками интимы аорты и липофиброзными бляшками, а также между различными органами и тканями. Таким образом, можно говорить об ассоциации данной мутации с атеросклеротическим поражением сосудов. Представленная информация может быть полезна для клиницистов и научных работников для ранней своевременной диагностики у пациентов, имеющих предрасположенность к атеросклерозу и предупреждения развития его острых клинических проявлений и осложнений.

Список литературы:

1. Consigny P.M. Pathogenesis of atherosclerosis. // A.J.R. Am. J. Roentgenol.,1995, Mar., V.164(3), P.553-558, Review.

2. Incalcaterra E., Hoffmann E., Averna M.R et al. Genetic risk factors in myocardial infarction at young age.// Minerva Cardioangiol., 2004, Aug.,V.52(4), P.287-312.

3. Т.Э. Иващенко, Д.Л. Стрекалов, Д.В. Соловьева и др. Тестирование генетической предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям и генетический паспорт.// Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике, выпуск 5, “Альфа-Виста”, Новосибирск, 2004 г. 

4. В.С.Баранов, Е.В. Баранова, Т.Э. Иващенко и др. Геном человека и “ гены предрасположенности” (Введение в предиктивную медицину). - СПб.: Интермедика, 2000 г., 271 с.

5. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин А.В., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Прямая количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома.// Фундаментальные науки и практика, Материалы трудов второй международной телеконференции, 2010 г., т.1, №2, стр.19-21.

6. М.М. Иванова, М.А. Сазонова, А.В. Желанкин, К.Ю. Митрофанов, З.Б. Хасанова, И.А. Собенин, В.А. Мясоедова, А.Ю. Постнов, А.Н. Орехов. Мутации митохондриального генома в патологии человека.// Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии. Материалы трудов третьей международной телеконференции, октябрь-ноябрь 2010 г.

7. Sazonova MA, Budnikov YY, Khazanova ZB, Postnov AY, Sobenin IA, Orekhov AN. Direct quantitative assessment of mutant allele in mitochondrial genome in atherosclerotic lesion of human aorta. 76th Congress of the European Atherosclerosis Society, Helsinki, Finland, June 10-13, 2007. Atherosclerosis Suppl. 2007 8(1):45-46.

8. Postnov AY, Sazonova MA, Budnikov YY, Khazanova ZB, Sobenin IA, Orekhov AN. Association of somatic mitochondrial mutations with atherosclerosis. 76th Congress of the European Atherosclerosis Society, Helsinki, Finland, June 10-13, 2007. Atherosclerosis Suppl. 2007 8(1):46.

9. Sazonova M, Andrianova I, Khasanova Z, Sobenin I, Postnov A. Quantitative mitochondrial genome mutation investigation and possible role of the somatic mutations in development of atherosclerotic lesion of human aorta. 77th Congress of European Atherosclerosis Society, Istanbul, Turkey, April 26-29, 2008. Atherosclerosis Suppl. 2008, 9(1):113.

11. Sazonova MA, Budnikov YeYe, Khazanova ZB, Postnov AYu, Sobenin IA, Orekhov AN. Possible role of somatic mitochondrial mutations in the development of atherosclerotic lesion of human aorta. ACC 57th Annual Scientific Session, Chicago, USA, March 29 – April 1, 2008. J Am Coll Cardiol 2008, 51(10) Suppl.A:A285.

12. Сазонова МА, Андрианова ИВ, Будников ЕЮ, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Постнов АЮ, Орехов АН. Прямая количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома. XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 14-18 апреля 2008. Тезисы докладов, стр. 414.

13. Собенин ИА, Мясоедова ВА, Сазонова МА, Кириченко ТВ, Чупракова ОВ, Кожевникова ЮА, Орехова ВА, Рудимов ЕГ, Орехова ЕА, Савинкова ИГ, Неробов ПЛ, Орехов АН. Разработка метода комплексной оценки риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений на основе анализа генотипа и фенотипа. Сборник тезисов. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления <Живые системы> ФЦП <Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы>. Москва, 25-27 ноября 2009 г., 134-135

14. Сазонова МА, Иванова ММ, Желанкин АВ, Митрофанов КЮ, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Мясоедова ВА, Постнов АЮ, Орехов АН. Ассоциация мутации митохондриального генома 652INSG с атеросклеротическими поражениями человека. Фундаментальные науки и практика 2010,1(4)168-171

15. Сазонова МА, Иванова ММ, Желанкин АВ, Митрофанов КЮ, Коробов ГА, Мясоедова ВА, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Постнов АЮ, Орехов АН. Детекция митохондриальной делеции гуанина в позиции 652 при атеросклеротических поражениях человека. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)105-107

16. Собенин ИА, Сазонова МА, Мясоедова ВА, Кириченко ТВ, Иванова ММ, Постнов АЮ, Орехов АН. Полиморфизм 3256С/Т митохондриальной ДНК как маркер ишемической болезни сердца и атеросклероза. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)108-110

17. Желанкин АВ, Сазонова МА. Роль мутаций митохондриального генома человека в развитии сахарного диабета 2 типа, артериальной гипертонии и различных видов кардиомиопатии. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)85-87

18. Митрофанов КЮ, Сазонова МА. Связь мутаций митохондриального генома человека с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)92-96

19. Chen X, Prosser R, Simonetti S, Sadlock J, Jagiello G, Schon EA. Rearranged mitochondrial genomes are present in human oocytes.// Am J Hum Genet. 1995, Aug.,57(2), P.239-247.

20. Yeh JJ, Lunetta KL, van Orsouw NJ, Moore FD Jr, Mutter GL, Vijg J, Dahia PL, Eng C. Somatic mitochondrial DNA (mtDNA) mutations in papillary thyroid carcinomas and

differential mtDNA sequence variants in cases with thyroid tumours.// Oncogene. 2000,

Apr 13,19(16), P.2060-2066.

21. Nishigaki Y, Marti R, Hirano M. ND5 is a hot-spot for multiple atypical mitochondrial DNA deletions in mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy. //Hum Mol Genet. 2004, Jan 1,13(1), P.91-101.

22. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин А.В., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б.,Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Детекция мутации митохондриального генома человека 652insG при атеросклеротических поражениях сосудов человека. Молекулярная диагностика-2010. Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том V, стр. 109-112.

23. Постнов А. Ю., Сазонова М.А., Собенин И.А. Прямая количественная оценка аллеля митохондриального генома, первые результаты: ассоциация с атеросклерозом. Молекулярная диагностика-2010. Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том III , стр. 109-112.

24. Agaton C., Unneberg P., Sievertzon M. et al. Gene expression analysis by signature pyrosequencing.// Gene, 2002, May 1, V. 289 ( 1 - 2 ), P. 31 - 39.

25. Wasson J., Scolnick G., Love-Gregory L. et al. Assesing allele frequencies of single nucleotide polymorphisms in DNA pools by pyrosequencing technology.// BioTechniques, 2002, May, V.32, P.1144 - 1152.