|
Учреждение Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им.Б.П. Константинова РАН (г. Гатчина)
Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.
Бактерии Deinococcus radiodurans способны к выживанию при дозе гамма-облучения, превышающей 1,7 МРад, и обладают эффективной системой репарации ДНК. В основе модели процесса гомологической рекомбинационной репарации лежит способность нуклеопротеинового филамента катализировать in vitro гомологическое спаривание и обмен нити с линейной молекулы днДНК фага М13 на кольцевую ДНК того же фага. Полярность реакции обмена нити ДНК in vitro, катализируемой D. radiodurans RecA белком с длинными ДНК субстратами на основе фага М13 была показана в работах [2, 3]. Для установления молекулярного механизма рекомбинационного обмена нитей ДНК, активируемого пресинаптическим комплексом (ПК) с короткими ДНК субстратами, нами была разработана экспериментальная модельная система с использованием методов флуоресцентной спектроскопии, где в качестве субстратов ДНК использовали олигонуклеотиды (длиной 30-100 нуклеотидов), меченные флуоресцентными метками [3]. Для исследования RecA-зависимого обмена нитей ДНК между 24 нп дуплексной ДНК и гомологичной онДНК применяли метод флуоресцентного гашения. В типичном тесте 5’-конец днДНК был помечен флуоресцеином, а комплементарный 3’-конец - дапсилом. Перекрывание между флуоресцентным спектром испускания флуоресцеина (донора) со спектром поглощения дапсила (акцептора) приводило к гашению флуоресценции в дуплексе. Замещение нити ДНК в реакции приводило к усилению флуоресцентного сигнала при отделении донора от акцептора.
Рис. 1. Кинетические кривые реакции замещения нити ДНК, катализируемой белком RecA из D. radiodurans (DrRecA). Обозначения: (А) кривая 1 – инкубация белка DrRecA (1mkM) с двунитевой флуоресцентномеченной ДНК (3mkM) в течение 5 минут при 37ºС с последующим добавлением однонитевой ДНК (3mkM); кривая 2 – инкубация белка DrRecA (1mkM) с однонитевой ДНК (3mkM) в течение 5 минут при 37ºС с последующим добавлением двунитевой флуоресцентномеченной ДНК (3mkM); (В) схема реакции.
In vitro методом флуоресцентного гашения в режиме реального времени нами было показано, что ПК, образованный DrRecA белком на двунитевой ДНК более эффективно катализирует реакцию замещения нити ДНК, чем подобный комплекс на однонитевой ДНК. Этот результат повторялся многократно в последующих экспериментах.
Список литературы:
1. Kim JI, Cox MM. The RecA proteins of Deinococcus radiodurans and Escherichia coli promote DNA strand exchange via inverse pathways//Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Jun 11;99(12):7917-21.
2. Kim JI, Sharma AK, Abbott SN, Wood EA, Dwyer DW, Jambura A, Minton KW, Inman RB, Daly MJ, Cox MM. RecA Protein from the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans: expression, purification, and characterization// J Bacteriol. 2002 Mar;184(6):1649-60.
|
