Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 68-й научной итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 20-22 апреля, 2009 год); под реакцией академика РАМН В.В. Новицкого, член. корр. РАМН Л.М. Огородовой

Посмотреть титульный лист сборника

Скачать сборник целиком (1,5 мб)

 

В свете данных о радиационно-индуцированном мутагенезе, известно, что ионизирующее излучение может действовать на генетический аппарат косвенно. Образованные в результате прохождения ионизирующих частиц через цитоплазму радикалы, обладают высокой реакционной способностью. Большое значение имеют первичные и вторичные продукты радиолиза воды. Пероксид водорода является вторичным продуктом радиолиза воды [3]. Кластогенная активность пероксида водорода в настоящее время подтверждена работами многих исследователей [1,4]. Однако вопрос об  анеугенном эффекте пероксида водорода остается открытым. Учитывая тот факт, что тестируемый фактор может обладать одновременно кластогенной и анеугенной активностью, появляется необходимость комплексной оценки генетического эффекта. Данный подход в будущем может явиться диагностическим инструментом для принятия своевременных профилактических мер и определения индивидуальной чувствительности к тем или иным вредным производственным факторам.
Кластогенные повреждения хромосомного и хроматидного типа являются следствием разрывов в цепи ДНК и образованием сшивок ДНК-белок. Модификация структур обеспечивающих клеточное деление является причиной неправильной митотической сегрегации хромосом и, как следствие, появление анеуплоидных клеток, что характеризует анеугенную активность мутагена [1].
Целью исследования явился комплексный анализ структурных и числовых хромосомных нарушений в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии различными концентрациями пероксида водорода.
Материалом исследования служила кровь здорового мужчины. Инкубация культуры лимфоцитов периферической крови с различными концентрациями пероксида водорода (50mM, 100mM, 150mM, 200mM) явилась  экспериментальной моделью окислительного стресса, возникшего в ходе прохождения ионизирующего излучения. Мутаген в исследуемой концентрации добавлялся на 24-часу культивирования.
Объектом исследования  кластогенных нарушений служили препараты хромосом, приготовленные согласно классической методике с дальнейшим окрашиванием красителем Гимза. Фиксацию клеток проводили на 72-часу культивирования, то есть после двух клеточных делений. Для выявления кластогенных повреждений анализировали 300 метафазных пластин в каждом препарате с исследуемой концентрацией пероксида водорода. Рутинно-окрашиванные препараты анализировались на световом микроскопе.
Объектом исследования числовых нарушений были препараты двуядерных цитохалазинблокированных лимфоцитов с использованием центромероспецефичных зондов комплементарных альфа-сателлитным последовательностям центромерных регионов 12-ой и Х-хромосом. Препараты для интерфазного FISH-анализа готовили согласно принятой методике. Анализ результатов проводили при 1000-кратном увеличении в ультрафиолетовой области спектра с набором соответствующих светофильтров. При  анализе учитывались все случаи аномального распределения числа гибридизационных сигналов в ядрах. Для каждой реакции гибридизации анализируется не менее 1000 интерфазных ядер в каждом препарате с исследуемой концентрацией пероксида водорода [2].
Структура кластогенных повреждений, выявленных в настоящей работе, представлена одиночными и двойными разрывами, а также фрагментами. Нарушения анеугенного типа представлены главным образом отставаниями и нерасхождениями по маркированным хромосомам, а также образованными микроядрами.

Таблица

Распределение числа гибридизационных сигналов в ядрах лимфоцитов при инкубировании культуры лимфоцитов с разными концентрациями пероксида водорода

Концентрация пероксида водорода, [mM]	Анеугенные нарушения, кол-во на стекло, (частота)
	12 R			X G			Mn**
	2R-2R	1R-3R	0R-4R	1G-0G	1G-1G	0G-2G
0mM	~1000	0(0)	0(0)	0(0)	~1000	0(0)	5(0,005)
50mM	~1000	1(0,001)	0(0)	1(0,001)	~1000	2(0,002)	10(0,01)
100mM	~1000	7(0,007)*	3 (0,003)	0(0)	~1000	3(0,003)	11(0,011)
150mM	~1000	0(0)	0(0)	0(0)	~1000	0(0)	9(0,009)
200mM	~1000	0(0)	0(0)	0(0)	~1000	3(0,003)	12(0,012)

 

*- достоверность различий (р<0,05)  по сравнению с контрольной группой

**- достигнутый уровень значимости (р<0,05) для дозазависимой корреляции по Спирмену

R-красный сигнал (12 хромосома), G-зеленый сигнал (Х-хромосома), Mn – микроядра

Анализ полученных данных проводился с использованием пакета программ STATISTICA 6.0. Для определения дозазависимого эффекта в образовании кластогенных нарушений была применена ранговая корреляция Спирмена. Выявлена положительная корреляция между повышением концентрации пероксида водорода и увеличением частоты появления одиночных разрывов (R=0,97467, p=0,004818), двойных разрывов (R=0,974679, p=0,004818) и фрагментов (R=0,9, p=0,03738). Также была выявлена положительная корреляция между повышением концентрации пероксида водорода и увеличением частоты появления микроядер (R=0,97467, p=0,0037). Для анализа анеугенных нарушений применяли непараметрические критерии. В ходе сравнения с контрольной группой были выявлены достоверные различия  относительно нерасхождений 12 хромосомы (р=0,0016) при инкубации культуры вместе с 100 mM пероксида водорода. Относительно нерасхождения 12 хромосомы в других исследуемых группах, а также нерасхождения Х-хромосомы во всех исследуемых группах, то достоверных различий не наблюдалось. Результаты данной работы подтверждают кластогенный дозазависымый эффект пероксида водорода. На основании полученных данных нельзя сделать вывод об анеугенном дозазависимом эффекте пероксида водорода, однако, можно предположить, что воздействие определенных концентраций пероксида водорода явилось причиной появления анеуплоидных клеток. Таким образом, пероксид водорода в моделях радиационного воздействия проявляет в большей степени кластогенную активность.

Список литературы:
1.    Бочков, Н. П. Наследственность человека и мутагены внешней среды / Н. П. Бочков, А. Н. Чеботарев. – М.: Медицина, 1989. – 170с.
2.    Тимошевский В. А, Лебедев И. Н., Назаренко С. А. Биологическая индикация мутагенных воздействий: анализ числовых хромосомных нарушений в интерфазных клетках человека. Учебное пособие. Серия «Наследственность и здоровье». Выпуск 7. Томск. «Печатная мануфактура». 2006. – 39 с.
3.    Цыб, А. Ф. Радиация и патология / А. Ф. Цыб. – М.: Высш. шк., 2005. – 341 с.
4.    Garcia C., Filippi S., Mosesso P. et al. The protective effect of L-carnitine in peripheral blood human limphocytes exposed to oxidative agents // Mutagenesis – 2005.- vol.21 №1. – P. 21-27.