|
ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г. Томск)
Эта работа опубликована в сборнике "Науки о человеке": материалы IX
конгресса молодых ученых и специалистов (Томск, 28-29 мая 2010 г) / Под ред. Л.М.
Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2010. – 113 с.
Посмотреть обложку сборника
Скачать сборник целиком
Ферменты широко применяются в различных областях практической деятельности и являются важным объектом биотехнологии. Однако их использование часто ограничено параметрами стабильности при хранении. Ключевым моментом для успешного практического использования ферментов в настоящее время является выяснение механизмов инактивации и поиск путей их стабилизации.
Целью работы было исследовать влияние магнитных наночастиц феррита кобальта, полученных методом механохимического синтеза на базе ОСМ ТНЦ СО РАН [1], на каталитическую активность и стабильность перокисдазы хрена. Интерес к данному ферменту обусловлен его широким использованием в молекулярной биологии и клинической диагностике.
Материал и методы. Суспензию частиц нанопорошка феррита кобальта (1 мг/мл) в натрий-фосфатном буфере (рН=7,0) получали методом ультразвуковой дезинтеграции (Bandelin HD2070) и добавляли раствор пероксидазы до конечной концентрации 1 мкМ. Ферментативную активность определяли по окислению ортофенилендиамина перекисью водорода в присутствии пероксидазы спек-трофотометрическим методом (Unico 2800) в нормальных условиях и при изменении внешних параметров: рН среды реакции (от 3,0 до 9,0) и высокотемпературном воздействии на фермент 65 и 99 °С в течение 30 минут. Для исследования изменения активности фермента при хранении удельную активность измеряли с интервалом 10 суток течении 255 дней.
Результаты и обсуждение. При исследовании влияния наночастиц феррита кобальта на ферментативную активность пероксидазы хрена показано, что инкубация с наночастицами приводила к снижению удельной активности фермента от (9,63±0,07) до (8,69±0,07) мкМ/мин-мг*104, и не оказывали влияния на рН оптимум и термостабильность фермента.
Рис 1. Динамика изменения удельной активности пероксидазы хрена при хранении в присутствии и без наночастиц феррита кобальта
Анализ изменения кинетических параметров пероксидазы хрена, проинкубированной с частицами феррита кобальта, - сочетанное увеличение Km от (2,65±0,10) до (3,40±0,04) мМ и Vmax от (9,5±0,26)*10-3 до (12,93±0,38)*10-3 мМ/сек, позволяет сделать вывод о влиянии наночастиц по типу бесконкурентного ингибитора [2]. Однако, хранение фермента в присутствии наночастиц феррита кобальта позволяло ферменту длительное время сохранять каталитическую активность (Рис.). Так, в течение 30 суток ферментативная активность пероксидазы в присутствии наночастиц оставалась на постоянном уровне и на 255 сутки составляла не менее 40% от исходного уровня активности, в то время как в контроле на 55 сутки фермент был полностью инактивирован. Учитывая, что ведущим механизмом инактивации ферментов является его окисление, приводящее к нарушению структуры белка и, как следствие, инактивации, сделано предположение, что наночастицы феррита кобальта способны препятствовать данному процессу.
Заключение. Наночастицы феррита кобальта синтезированные методом механохимии могут быть использованы в качестве эффективных стабилизаторов, значительно продляющих срок хранения фермента.
Список литературы:
1. Найден Е.П. и др.// Журнал Физика твердого тела. - 2008. - Т.50. - С. 857
2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: «Мир», 1982. - Т.1. - 392 с.
|
