Разработанная схема иммунизации кроликов комплексом мембранных антигенов Borrelia garinii, полученных путем сонификации спирохет в присутствии детергентов позволила решить проблему продуцентов специфических противоборрелиозных сывороток для использования в иммуноанализе. Ранее нами была показана возможность применения IgG кролика для получения конъюгированных гибридных иммуноглобулинов [1].
Сравнивая различные методы выделения и очистки антител из гипериммунных сывороток животных, мы пришли к выводу, что наиболее оптимальным по соотношению «выход-чистота» целевого белка является комбинация преципитации IgG полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 (ПЭГ-6000) с последующей анионообменной хроматографией на DEAE-Toyopearl 650 M. Был введен дополнительный метод контроля - определение содержания ПЭГ-6000 на различных этапах получения гибридных антител с применением реагента Несслера-Винклера. Проведенные исследования показали, что содержание преципитирующего агента составляет около 27 % от того объема, который был использован на этапе осаждения иммуноглобулинов. Молекулы полиэтиленгликоля обладают гидроксогруппами, которые также подвержены окислению при взаимодействии с перйодатом натрия (NaJO4)-вследствие этого они могут образоваать конъюгаты типа IgG-ПЭГ, что является недопустимым.
Цель работы − разработать метод выделения и очистки противоборрелиозных IgG из сыворотки крови гипериммунных кроликов, обеспечивающий достаточную чистоту и выход для получения конъюгатов с IgG человека.
Материалы и методы исследования. Материалом исследования служила сыворотка крови гипериммунных кроликов, полученная путем пункции краевой вены уха. Все работы с животными проводились согласно требованиям WSPA.
В ходе исследования были сравнены следующие методы получения иммуноглобулиновой фракции сыворотки крови:
Преципитация с применением 25 % (вес/объем) сульфата аммония (Метод 1);
Преципитация с применением 45 % (вес/объем) сульфата аммония (Метод 2);
Преципитация белков-контаминантов с каприловой кислотой (Метод 3);
Комбинация метода осаждения 33 % (вес/объем) сульфатом аммония с последующей анионообменной хроматографией на DEAE-Toyopearl 650 M (Метод 4).
Используемые в работе реагенты имели квалификацию х.ч. или ч.д.а., очистку антител проводили с применением хроматографической системы AKTA Explorer 100 Air с коллектором фракций Frac-950 (“Amersham Biosciences”).Ионообменную хроматографию проводили на колонне ХК 16/10 с сорбентом DEAE-Toyopearl 650 M (“ToyoSoda”), образец наносили в 10 мМ натрий-фосфатном буфере с рН 6,3; элюцию вели 20 мМ натрий-фосфатным буфером с 1 M NaCl, pH 6,3. Для характеристики молекулярно-массового распределения в полученных препаратах проводили электрофорез в 7,5 % полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а также гель-хроматографию (GF) на колонне XK 16/90 с сорбентом Sepharose 4B FF (Amersham Bio.), для элюции использовали 10 мМ фосфатно-солевой буфер, рН 7,2. Иммуноэлектрофоретический анализ (ИФ) в 1,5 % агарозном геле проводили с использованием антисыворотки овцы к белкам сыворотки крови кролика (“Sigma”). Концентрацию белка (CP) определяли используя микромодификацию метода Брэдфорд. Для оценки специфической активности полученных препаратов IgG были применены непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) и двойная радиальная иммунодиффузия по методу Оухтерлони (ДРИД).
Как было уже сказано выше, основным критерием для выбора наиболее оптимального метода являлось соотношение чистоты и специфической активности препарата. Полученные нами данные (Таблица 1) позволяют судить о возможности применения исследуемых методов для препаративного получения противоборрелиозного IgG кролика.
Таким образом, нами было установлено, что оптимальным методом для получения гипериммунного противоборрелиозного кроличьего IgG является комбинированный метод преципитации 33 % сульфатом аммония с последующей анионообменной хроматографией. Выход белка составил 16,5 мг/мл сыворотки, при этом на иммуноэлектрофореграмме присутствует лишь одна дуга преципитации, соответствующая Ё-глобулиновой фракции.

Список литературы:
1.    Карбышев М.С. Химическое конструирование гибридных иммуноглобулинов // Материалы всероссийской 65-ой итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова. Томск., 26-28 апреля 2006. - СибГМУ, - 2006. - С. 24 - 26.