Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Проблемы и перспективы современной науки» (2008 год, выпуск 2), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Одними из распространенных загрязнителей окружающей среды являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ): нафталин, антрацен, фенантрен. Они образуются при неполном сгорании ископаемого топлива, в результате техногенной деятельности человека и накапливаются в почвах, донных отложениях, водоёмах, воздухе. ПАУ являются мутагенными и канцерогенными соединениями и представляют большую опасность для живых организмов [7].
Основным процессом деградации ПАУ в природных условиях является микробная утилизация [6]. Несомненно, что биологические методы очистки окружающей среды наиболее безопасны, эффективны и менее затратные по сравнению с методами химической и физической очистки.
Большим метаболическим потенциалом в отношении деградации углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas. [4]. У штаммов псевдомонад гены утилизации нафталина и его производных могут иметь как плазмидную, так и хромосомную локализацию [2]. Катаболические гены организованы в два оперона: первый (nah1) кодирует превращение нафталина в салицилат, второй (nah2) – утилизацию салицилата через катехол до интермедиатов цикла трикарбоновых кислот. Экспрессия обоих оперонов находится под позитивным контролем регуляторного гена nahR [11].
Превращение салицилата в катехол катализирует салицилат-1-монооксигеназа (салицилат-1-гидроксилаза), кодируемая геном nahG. Дальнейший метаболизм катехола может осуществляться двумя способами: 1) по орто-пути, когда образуется  сукцинил-CoA и ацетил-CoA с участием катехол-1,2-диоксигеназы, которая контролируется геном  cat A, 2) по мета-пути с образованием пирувата и ацетальдегида с участием катехол-2,3-оксигеназы, контролируемой геном nahH [10].
Также известно, что большинство изученных плазмид биодеградации ПАУ, как правило, относятся к группам несовместимости Р-2, Р-7, Р-9 [1].
Целью нашей работы было изучение почв, отобранных вблизи г. Пущино и г. Нижнекамска на наличие деструкторов салицилата и нафталина, исследование возможных путей деградации этих соединений и определение группы несовместимости плазмид.
Материалы и методы:
Были исследованы образцы почв г. Нижнекамска: N8 – из пос. Воскресенское, N9– Шламонакопитель и г. Пущино: NP10 – Эстакада старая и NP11 – Эстакада новая.
C исследуемыми образцами был поставлен опыт по экзогенной изоляции плазмид. 2 г образца каждой почвы культивировали в 10 мл 1/10 TSB в течение 12 ч на качалке при температуре 24-28 С [3]. В качестве реципиента использовали КТ2442. Коньюгационный перенос плазмид с реципиентом P.putida KT2442 осуществляли на фильтрах «Millipore» на агаризованной среде в течение 12 ч. Культуры смывали с фильтров 1 мл среды Эванса [5], разведения высевали на агаризованную среду Эванса, содержащую канамицин (50 мкг/мл), рифампицин (50 мкг/мл), нафталин и салицилат в качестве единственных источников углерода и энергии. Аналогичным образом ставили контроль почвенных образцов и реципиента.
Из всех трансконъюгантов была выделена плазмидная ДНК методом щелочного лизиса [8], тотальная ДНК [9] и проведен ПЦР анализ на гены nahG, nahU, ori-rep IncP-7, par IncP-9,  kor-rep IncP-9.
Результаты и обсуждение:
В опыте по экзогенной изоляции только для почвы NP11 было получено 7 трансконъюгантов с KT2442 на селективной среде с салицилатом в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 1).

Таблица 1. Количество колоний выросших при высевании клонов и почвенных образцов

После перекалывания клонов на среду с E Km50Rif50Gen и E Km50Rif50Nah не проросла ни одна колония. Возможно, что полученные клоны растут только на салицилате. Отрицательная реакция клонов на катехол при опрыскивании 0,1 мМ раствором катехола свидетельствует о том, что метаболизм салицилата идет через катехол по орто-пути.
По результатам ПЦР анализа был выявлен ген классической салицилатгидроксилазы у всех семи экзогенных изолятов, что свидетельствует о деградации салицилата через катехол. Отрицательная реакция на неклассическую салицилатгидроксилазу указывает на отсутствие гена NahU.
ПЦР анализ семи экзогенных изолятов на гены par  и  kor-rep IncP-9 не обнаружил сигналов, а анализ на ген ori-rep IncP-7 показал сильные сигналы, что свидетельствует о принадлежности всех семи плазмид трансконъюгантов к Р-7 группе несовместимости.
Во всех исследуемых образцах была обнаружена положительная реакция на ген, контролирующий катехол-2,3-оксигеназу. Но отрицательная реакция образцов с 0,1 мМ катехолом свидетельствует о том, что катехол-2,3-оксигеназа находится в неактивном состоянии и не экспрессируется.
Таким образом, в образце почвы NP11 обнаружены деструкторы салицилата, метаболизм которого идет через катехол по орто-пути. Плазмиды деградации салицилата относятся к Р-7 группе несовместимости.

Список литературы:
1.Кочетков      В.В,      Воронин      А.М.      Сравнительное      изучение      плазмид, контролирующих   биодеградацию  нафталина    культурой Pseudomonas // Микробиология. 1984. Т.53. С. 639-64.
2. Кошелева И.А., Измалкова Т.Ю., Соколов С.Л., Сазонова О.И., Боронин А.М. Структурная и функциональная вариабельность генетических систем катаболизма полициклических ароматических углеводородов у штаммов Pseudomonas putida // Генетика, 2003. Т. 39. № 9. С. 1185-1192.
 3. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Методы генетической инженерии.
 Молекулярное клонирование. М., «Мир». 1984. 480 с.
4. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (ed.), 1999. Shot Protocols  in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc. 4th ed., p.1056
5. Cerniglia C.E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons//Biodegradation.  1992. №3. Р.351-368.
6. Еvans С.G.Т., Herbert  D.,  Tempest D.W. The continuous cultivation of microorganisms: constriction of a chemo stat //Methods Microbiol.1970.Vol.2.P.277-327. Meyer S., Moser R.,.
7. Neef A., Stahl U., Kampfer P. Differental detection of key enzymes of polyaromatic-hydrocarbone-degrading bacteria using PCR and gene probes//Mycrobiology. 1999. Vol. 145. P.1731-1741
8. Miller E.C., Miller J.A. Searches for ultimate chemical cancirogens and their reactions with cellular macromolecules // Cancer., 1981. Vol.47. P.2327-2345
9. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold  Spring  Harbor  Laboratory Press, 1989.
10.Williams P.A., Sayers J.R. The evolution of pathways for aromatic hydrocarbon oxidation in Pseudomonas//Biodegradation. 1994. P. 195-217.
11.Yen K.M., Serdar C.M. Genetics of naphthalene catabolism in Pseudomonads // CRC Crit. Rev. Microbiol., 1988.Vol. 15. P. 247-268.