|
Государственный университет (г. Санкт-Петербург)
Государственная медицинская академия (г. Чита)
Гетерогенный катализ - реакции, идущие на разделе фаз; в частности, с иммобилизованными ферментами (катализаторами) на плотной и реагентами реакции - в жидкой фазе. Иммобилизацию на субстрат начали использовать в 19 веке - сначала микробов, затем энзимов, в основном с целью облегче¬ния удаления данных компонентов из продукта. В настоящее время гете¬рогенным катализом получают фруктозный сироп, аминокислоты, пе¬нициллины, акриламиды, гидролизованную лактозу. Иммобилизован-ные катализаторы применяются для производства агрохимикатов, фарма¬копрепаратов, продуктов тонкого органического синтеза, в нано¬технологиях. [8]
Иммобилизация часто повышает стабильность белка [8]; в организме ферментными ансамблями проще управлять (пример - каскад цитохромов в митохондриях), поэтому активно функциониру¬ющие клетки буквально насыщены разнородными мембранными и иными нанострук¬турами. На поверхностях (микробов …) происходит активация комплемен¬та, свертывающей системы крови /ССК/. "Мембранонезависимая" контактная фаза ССК в последнее время рассматрива¬ется лишь как звено для регуляции воспаления и фибринолиза [14], но не гемостаза. [14] Ключевым объектом в активации ССК считается тканевой фактор (TF) - мембранный рецептор фактора VIIa. Фосфолипидные фракции мозга, обогащенные тканевым факто¬ром, называют тромбопластином.
В процессе лизиса фибринового сгустка плазминоген, связыва¬ясь с фибрином, уже задает гетерогенность фаз; значимость фос¬фолипидных мембран клеток в данном процессе изучается. Грубая активация клеток (особенно с реакцией высвобождения гранул) такими раздражителями, как тромбин, фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа), радикалами может привести к апопто¬зу, блеббингу (сбросу поврежденных фрагментов клетки). Раз¬личные апоптические тельца, блебсы, везикулы и прочие осколки клеток относятся к микросомальной фракции. Для доказательства роли мик-росом (гетерогенного катализа) в фибринолизе были проведены замеры фибринолитической ак¬тивности после ультрацентрифугирования и фильтрации плазмы кро¬ви человека. Удаление субклеточных фракций центрифугированием привело к замедлению скорости растворения сгустка на 70% (со 178±4 минут в контроле до 305±10 минут в опыте; P<0,001). Итогом фильтрации эуглобулиновой фракции цитратной плазмы (через мембрану "Миллипор" /США/, пропускающей компоненты размером ме¬нее 220 нм) также стало торможение времени лизиса фибринового сгустка (на 15%; P<0,05). Влияние тромбопластина отслеживали после добавления к эуглобулиновой фракции плазмы эритроцитов, сенсибилизированных очищенным тромбопластином; фибринолиз ускорился на 13% (с 290±13 до 254±7 минут; Р<0,05). Роль микросом оказалась очевидной (стимуляция растворения фибрина). [Методи¬ки. Тромбопластин-обогащенную фракцию выделяли с использованием дезоксихолата натрия, разделяющего липидные и белковые компо¬ненты [2]; "сшивали" с эритроцитами 0,25% глута¬ровым диальдегидом. Контролем служили эритроциты, иммобилизован¬ные альбумином. Фибринолитическую активность оценивали по мето¬дике Kowarzik H., Buluk K., 1954. [1] ]
По данным литературы фибринолиз эффективен, когда плазмино¬ген и его активаторы связываются с клетками; особен¬но при наличии на их поверхностях протеаз, способных активиро¬вать плазминоген. [19] Найдено одно из мест посадки, наз¬ванное Plg-RKTс М. 17 кД. [23] "Фибринолитическим рецептором" считается и аннексин II моноцитов и макро¬фагов, определяющий за счет плазмина (протеолиза) продвижение макрофагов по межклеточному пространству. [9] Сайты связывания плазмино¬гена обнаружены не только на макрофагах [9], но и культивируемых эндотелиальных клетках, тром¬боцитах [5], белке С7 системы комплемента [21], некоторых компонентах внеклеточного матрикса, в том числе на фибронектине [16] (для ремодели¬рования интерстициального матрикса), тромбоспондине и даже иммунных комплексах /ИК/ (IgG). Плазмин совместно с тканевым активатором плазминогена (tPA) разрывает молекулу IgG c отщеплением Fab фрагмента; к остаткам лизина Fab-фрагмента прикрепляются новые порции плазминогена [16] (роль в солюбилизации ИК /?/).
Плазмин значим не только в растворении фибрина и расщеплении иммунных комплексов, но и в воспалении, овуляции, имплантации, нейродегенерации и других процессах. [16] tPA в центральной нервной системе экспрессируется на нейронах и микроглии; участвует в регуляции синаптической плас¬тичности, миграции и гибели клеток. Синаптическая плас¬тичность, в свою очередь, влияет на обучение, память, стрес¬с. [20] tPA ускоряет регенерацию нейронов (рост аксо¬нов). [20] В вегетативной нервной системе tPA высвобождается из терми¬нальных синаптических нервов, влияя таким образом на реологию крови. [20] Можно предположить, что выпадение фибриновых нитей (наносборка фибрин-мономеров) и их быстрое растворение крайне важны именно в нервной системе для проторения пути новых дендритов и веточек аксонов, возможно поэтому в данной ткани настолько высока тромбопластическая активность.
В негативном аспекте фибринолитическая терапия (активаторами плазминогена, плазмином, плазминогеном) при инфаркте миокарда может повлечь коронарную артериальную реокклюзию, связанную с расщеплением плазмином TFPI (tissue factor pathway inhibitor). Данный ингибитор конститутивно синтезируется эндотелиальными клетками и индуцированно под действием вводимого гепарина. [25] Сорбированный плазминоген и tPA используется опухо¬левыми клетками (для ускорения метастазирования), рядом бактерий (Leptospira interro¬gans [18], Borrelia burdorferi [7], стрептококками [24], Mycoplasma hyopneumoniae [3], некоторыми ки¬шечными палочками [17]), способствуя продвижению данных клеток по межклеточной строме тканей. Микробы с активным плазмином, с одной стороны, способны демоделировать ткань (что в какой-то степени выгодно макроорганизму при излишнем выпаде¬нии фибрина); с другой стороны, ранняя блокада инфекционного воспаления может оставить след неправильной архитектоники стромы. Сборка матриксных элементов (глюкозамингликанов, белковых воло¬кон /коллагена, эластина, нерастворимого фибронектина .../), синтезируемых стромальными клетками (тучными, фибробластами) теоретически сопоставима с разрастанием морозного узора на стеклах: неправильная затравка (предположительно фибрином) даст "фрактальные" (т.е. многоуровневые по масштабу) последствия, крайним выражением которых является возможный цирроз, формирование грубоволокнистой рубцевой ткани.
Поскольку значимость проблемы регенерации является архиваж¬ной и нанотехнологические биопленки все шире используются в ме¬дицине, особенно в стоматологии для управляемого движения нуж¬ных клеток, иммобилизованные фибринолитические ферменты (плаз¬мин, тканевой, урокиназный активаторы плазминогена) будут исс¬ледоваться и далее.
В.А.Chibber и сотр. [10] пришили плазминоген к агарозе (цианогенбромидом /CNBr/) и обработали урокиназой. Полученный таким образом иммобилизованный плазмин проявлял эстеразную, амидазную, протеазную активности. Фермент был устойчивым к вы¬соким концентрациям солей и моющим средствам, стабилен в тече¬ние длительного времени. [10]
H.Shankar и сотр. [13] сцепили плазмин с коллагеном (с помощью карбодиимида); фермент сохранял активность не менее 3 месяцев и не был чувствителен к действию альфа-2-антиплазмина. В присутствии альфа-2-антиплазмина иммобилизо¬ванный плазмин давал в два раза больше ПДФ (продуктов дегра¬дации фибрина), чем растворимый; в отсутствии ингибитора актив¬ность была равной. [13] То есть в условиях in vivo останется активным именно технологический плазмин. На плазмин (прикрепленный к эластическим коллагеновым тубулам) осаждается больше фибриногена и тромбоцитов, чем на саму матрицу [12], что свидетельствует об эффективности полученного биоматериала.
Иммобилизованный плазмин или плазминоген пытаются использо¬вать
- для улучшения перфузии тканей (в экспериментах на бедренной артерии собак локальный эффект оказался выше, чем от действия свободного плазмина [11]);
- в трансплантологии для борьбы с отторжением аллотрансплантата [12, 16]; в частности, предлагается обработка островков Лангерганса урокиназой и тромбомодулином, конъюги¬рованных с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и фосфолипидами [15];
- для повышения качества сосудистых протезов [22];
- для борьбы с отложением фибрина в легких крупного рогатого скота в ветеринарии;
- для аффинной очистки фибринолитических агентов посадкой ки¬шечных палочек с плазминогеном на материал хроматографической колонки [4]; и пр.
Таким образом, мембранные структуры задействованы в фибрино¬литическом процессе (микросомальная фракция плазмы крови су¬щественно /почти в два раза/ повышает скорость растворения фиб¬рина). По¬пытки использования гетерогенного катализа в фибринолизе с целью коррекции патологических состояний организма про¬должаются.
Литература
1. Дульянинова А.Ю. Участие тромбопластина в ферментных сис¬темах крови: Дис. … канд.мед.наук: 14.00.17. - Чита, 1999. - 136 с.
2. Лабораторные методы исследования системы гемостаза / В.П. Балуда, З.С. Барканан, Е.Д. Гольдберг и др. - Томск,1980. - 314с.
3. A processed multidomain Mycoplasma hyopneumoniae adhe¬sin binds fibronectin, plasminogen and swine respiratory cilia / L.M. Seymour, A. Deutscher, C. Jenkins et al. // J. Biologi¬cal Chemistry. - 2010. - V. 285. - P.33971-33978.
4. Activation of immobilized plasminogen by tissue acti¬vator / R.L. Silverstein, R.L. Nachman, L.L. Leung, P.C. Harpel // J. Biol. Chem. - 1985. - V. 260, N 18. - P. 10346-10352.
5. Activation of single-chain urokinase-type plasminogen activator by platelet-associated plasminogen / K.M. Baeten, M.C. Richard, S.M. Kanse et al. // J, Thrombosis and Haemosta-sis. - 2010. - V. 8, N 6. - P. 1313-1322.
6. Annexin II mediates plasminogen-dependent matrix inva¬sion by human monocytes: enhanced expression by macrophages / C. Brownstein, A.B. Deora, A.T. Jacovina et al. // Blood. - 2004. - V. 103, N 1. - P. 317-324.
7. Borrelia burdorferi infection-associated surface pro¬teins ErpP, ErpA and ErpC bind human plasminogen / C. Brisset¬te, K. Haupt, D. Barthel et al. // Infection and Immunity. - 2009. - V. 77, N 1. - P. 300-306.
8. Breba B.M. Immobilization of enzymes. A literature survey. / B.M. Breba, F. Batista-Viera // Methods in biotechno¬logy. - 2006. - V. 22. - P. 15-30.
9. Brownstein C., Deora A.B., Jacovina A.T. et al. Anne¬xin II mediates plasminogen-dependent matrix invasion by human monocytes: enhanced expression by macrophages // Blood. - 2004. - V. 103, N 1. - P. 317-324.
10. Chibber B.A. Immobilized human plasmins: preparation and enzymatic properties / B.A. Chibber, M.G. Leadbetter, E.T. Mertz // Preparative Biochemistry and Biotechnology. - 1974. - V.4, N 4. - P. 315-330.
11. Effect of bioresolving microsperic preparations of im¬mobilized fibrinolysin on the fibrinolysin system / L.A. Besso¬litsyna, A.V. Mazaev, A.V. Markosyan et al. // Bulletin of ex-perimental biology and medicine. - 1980. - V. 89, N 1. - P. 19-21.
12. Effect of soluble and immobilized plasmin on fibrino¬gen and platelets / F. Senatore, H. Shankar, C.H. Ho et al. // Thromb. Haemost. - 1990. - V. 64, N 3. - P. 445-449.
13. Enhanced in vitro fibrinolytic activity of immobilized plasmin on collagen beads / H. Shankar, F. Senatore, P. Zuniga, E. Venkataramani // J. Biomed. Mater. Res. - 1987. - V. 21, N 7. - P. 897-912.
14. Hack C.E. The coagulation system in sepsis / C.E. Hack // The sepsis text. - 2002. - Part 6. - P. 687-704.
15. Haj Chen. Co-immobilization of urokinase and thrombo¬modulin on islet surfaces by poly(ethylene glycol)-conjugated phospholipid / Chen Haj, Yuji Teramura, Hiroo Iwata // J. Cont¬rolled Release. - 2011. - V. 150, N 2. - P. 229-234.
16. Harpel P.C. Binding and activation of plasminogen on immobilized IgG / P.C. Harpel, R. Sullivan, C. Tsun-San // J. Biological Chemistry. - 1989. - V. 264, N 1. - P. 616-624.
17. Immobilization of plasminogen on Escherichia coli fla¬gella / K. Lahteenmaki, B. Westerlund, P. Kuusela, K. Korhonen // FEMS Microbiology Letters. - 1993. - V. 106, N 3. - P. 309-314.
18. Leptospiral endostatin-like protein A is a bacterial cell surface receptor for human plasminogen / A. Verma, C.A. Brissette, A.A. Bowman et al. // Infection and Immunity. - 2010. - V. 78, N 5. - P. 2053-2059.
19. Myohanen H. Regulation and interactions in the activa¬tion of cell-associated plasminogen / H. Myohanen, A. Vaheri // Cellular and Molecular life sciences. - 2004. - V. 61, N 22. - P. 2840-2858.
20. Nagai Nobuo. Role of tPA in neural system / Nobuo Na¬gai, Urano Tetsumei // Recent advances in thrombosis and hemos¬tasis. - 2008. - Part 4. - P. 314-327.
21. Reinartz J. Complement component C7 is plasmino¬gen-binding protein / J. Reinartz, G.M. Hansch, M.D. Kramer // J. Immunol. - 1995. - V. 154, N 2. - P. 844-850.
22. Shankar H. Co-immobilization and interaction of he¬parin and plasmin on collageno-elastic tubes / H. Shankar, F. Senatore, S. Avantsa // Biomaterials, artificiak cells, and ar-tificial organs. - 1990. - V. 18, N 1. - P. 59-73.
23. Strickland D.K. A new plasminogen receptor / D.K. Strickland // Thrombosis and Hemostasis. - 2010. - V. 115. - P. 1319-1330.
24. The mechanism of a bacterial plasminogen activator in¬termediate between streptokinase and staphylokinase / I.Y.Sazo¬nova, A.K. Houng, S.A. Chowdhry et al. // J. Biol. Chem. - 2001. - V. 276, N 16. - P. 12609-12613.
25. You fu Li M.D. Plasmin-mediated proteolysis of vascu¬lar endothelial cell heparin releasable tissue factor pathway inhibitor / M.D. You, F.A. Spencer, R.C. Becker // J. Thrombo¬sis and Thrombolysis. - 2003. - V.15, N 1. - P. 19-23.
|
