Сибирский государственный медицинский университет (г.Томск)

       Проведено цитогенетическое обследование здоровых и пораженных хронической описторхозной инвазией рабочих нефтегазовых производств на севере Томской области. Анализ числа лимфоцитов периферической крови с  аберрациями хромосом осуществлен у 94 человек ( 40  - хантов,  26 – русских и 28 – метисов). Инвазированных описторхами среди хантов было 12 человек, среди русских – 9, метисов - 10.    Микроядерный анализ лимфоцитов крови не зарегистрировал различий в уровне цитогенетических нарушений у здоровых лиц различного этнического происхождения. Сравнительный анализ с результатами обследования  русских, хантов и метисов показал, что во всех случаях количество  бласттрансформированных лимфоцитов с микроядрами в периферической крови у больных описторхозом людей (0,91±0,04% - ханты; 1,24±0,08% - русские; 1,10±0,06% - метисы) достоверно (во всех случаях р<0,001) превышало их содержание у здоровых доноров (соответственно 0,59±0,04; 0,61±0,05; 0,43±0,03%).  При этом обращало на себя внимание то, что содержание  лимфоцитов,  способных претерпевать бласттрансформацию, у больных с описторхозной инвазией во всех случаях оказалось значительно  ниже  (Р<0,001)  соответствующих значений у здоровых доноров, что свидетельствует о низкой функциональной активности Т-лимфоцитов периферической крови у больных описторхозом.

   Анализ хромосомных метафазных  пластинок  лимфоцитов   периферической   крови свидетельствовал, что как в случае хантов, так и метисов число клеток с  хромосомными аберрациями у приехавших русских - больных описторхозом  превышало их содержание  у  здоровых людей  более  чем  в  5,6 раза  (Р<0,001). В то же время у аборигенов, в отличие от мигрантов повышение составило  23%.  Наиболее низкие значения цитогенетической патологии при описторхозной инвазии были зарегистрированы в  лимфоцитах крови метисов. У приезжих европеоидов  с манифестным типом заболевания число клеток со структурными нарушениями было особенно  повышенным, по сравнению с больными, с малосимптомным типом заболевания описторхозом .

ДНК-репаративный синтез, индуцированный УФ-облучением, определяли с помощью метода сцинтилляционной радиометрии по включению ³Н-тимидина в общую массу клеток при подавлении репликативного синтеза ДНК гидроксимочевиной (10 кмоль/мл).

Установлено, что у здоровых доноров независимо от возраста и национальной принадлежности интенсивность ДНК-репаративного синтеза была сопоставимой (p>0,05).

Изучение последствий стимуляции ДНК-репарации УФ-облучением свидетельствует о том, что индекс стимуляции разли­чен в культурах клеток больных описторхозом европеоидов, хантов и метисов. Так у больных европеоидов интенсивность репаративного синтеза была в 2-3 раза ниже наблюдаемой у больных описторхозом хантов и метисов. Наиболее интенсивно этот процесс протекал  в клетках больных метисов, что, по-видимому, свидетельствует в пользу предположения о наличий высокой антимутагенной защиты генетических структур в клетках организма метисов. Не исключено, что именно активное функционирование систем защиты генетических структур у метисов может быть предопределяющей в высокой адаптагенной устойчивости именно метисов к неблагоприятным экстремальным факторам севера Западной Сибири.

       Ранее нами было показано (Ильинских с соавт., 1989), что у некоторых рабочих-нефтяников занятых в сфере нефтедобычи вахтовым режимом труда повышен уровень цитогенетических нарушений (микроядерный тест), при этом было высказано предположение, что нефть обладает генотоксическим действием. Прямые исследования проведенные  рядом ученых (Khalil, 1995; Brasiak, 2000) позволили доказать, что нефть и ее дериваты обладают выраженным мутагенным и канцерогенным эффектом. Рак мочевого пузыря и мочевыводящих путей является наиболее распространенной неопластической патологией у работающих на нефтепромыслах, что связывают с присутствием в нефти канцерогенных  полиароматических углеводородов,  продукты метаболизма которых  выводятся из организма с мочой, что может оказать канцерогенное воздействие на ткани мочевого пузыря и мочевыводящих путей  (Измайлова, 2011). Наряду с этим установлен генетический полиморфизм чувствительности людей к канцерогенному и мутагенному действию некоторых компонентов нефти (Григорьева, 2007). Особое внимание в этой связи привлекает ген CYP1А1, связанный с продукцией цитохрома Р4501А1, способствующий биотрансформации ароматических углеводородов, поступающих в организм человека. У некоторых людей из-за мутаций этого гена процессы биотрансформации углеводородов значительно снижены и при этом существенно возрастает мутагенный и канцерогенный риск (Daly, 1995).

      В связи с изложенным целью настоящей работы является исследование уровня цитогенетических нарушений (микроядерный тест) в эпителиоцитах мочевыводящих путей и определение уровня  канцерогенного полиароматического углеводорода бен(а)пирена (3,4 бензпирен)  в моче у рабочих-нефтяников севера Западной Сибири в связи с наличием или отсутствием в их генотипе мутантных аллелей гена CYP1A1.

    Обследовано 517 мужчин, работающих на нефтепромыслах севера Томской и Тюменской областей. Настоящая работа проведена в марте-июне 2010 года, при этом были обследованы только те лица, которые подписали добровольное информированное согласие относительно определения у них в клетках эпителия цитогенетически аномальных клеток (микроядерный тест), уровня бенз(а)пирена в моче и мутантных форм гена CYP1A1. Помимо этого нами проведено анкетирование, позволяющее составить представление о генеалогии (расовой и национальной принадлежности) и факторах риска в жизнедеятельности обследуемого донора. В зависимости от стажа работы рабочих-нефтяников разделили на 2 группы: имеющие стаж работы на нефтепромыслах 1-5 лет (132 человека) и 10-15 лет (137 человек). Во всех случаях обследованы рабочие, занятые выполнением современных видов вахтового механизированного физического труда на нефтепромыслах севера Западной Сибири.  Контролем послужили 99 (стаж 1-5 лет) и 106 (стаж 10-15 лет) сотрудников административно-хозяйственного аппарата нефтепромыслов, непосредственно не контактирующих с процессами нефтедобычи. Возраст рабочих-нефтяников составил 38,6±5,4 года, а административно-хозяйственного персонала – 39,0±4,2. Согласно данных анкетного опроса и медицинских карт, обследованные в течении  года не проходили рентгеновских процедур и не болели вирусными инфекциями. У всех образцы мочи были получены в конце рабочей смены. В моче был определен уровень бенз(а)пирена методом люминесцентной фотометрии на анализаторе ФЛЮОРАТ-92-2М. Кроме того, из осадка мочи были изготовлены мазки эпителиоцитов и сопутствующих клеток. После фиксации по методу Карнуа мазки окрашивали красителем Романовского-Гимза и анализировали на предмет присутствия клеток с микроядрами  согласно методике и критериям описанным ранее (Ильинских с соавт., 1992). Одновременно из осадка клеток была получена ДНК, в которой нами было проведено исследование наличие мутации в 7-ом экзоне гена CYP1A1 (Ile462Val), приводящей к изменению каталитической активности фермента (Hayashi et al., 1991). Выделение ДНК из клеток проводили методом фенол-хлороформной экстракции.  Полиморфизм гена CYP1A1, исследовали методом изучения длин рестрикционных фрагментов с использованием рестриктаз фирмы «Сибэнзим». Фрагменты ДНК разделяли путем электрофореза в 7-8%-ном полиакриламидном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

     Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA v.6.0, BIOSYS-2, Microsoft Access, BIOSTAT (Primer of Biostatistic version 4.03). Частоты гаплотипов сцепленных локусов для гена CYP1A1 рассчитывали в программе “The EH software program, Rockefeller University, NY”. Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова не выявило отличий от нормального. Анализ статистических различий качественных признаков производили с использованием теста χ² с поправкой Йейтса на непрерывность (Боровиков, Боровиков, 1997). Различия сравниваемых результатов (X±m_, где X – выборочное среднее арифметическое, m – ошибка среднего арифметического) считались достоверными при достигнутом уровне значимости p<0,05.

Как свидетельствуют данные таблицы 1.  количество рабочих-нефтяников с различными генотипами по гену CYP1A1 существенно различается в зависимости от стажа работы на нефтепромыслах. Число лиц с генотипом Ile/Ile было достоверно выше (p>0,01) среди тех рабочих которые проработали 10-15 лет, чем среди рабочих-нефтяников с небольшим стажем работы в условиях нефтепромыслов, при этом в группе с большим стажем работы на нефтепромыслах резко сокращено количество гетерозигот (Ile/Val) и полностью отсутствуют гомозиготы по мутации (Val/Val). Среди административно-хозяйственного персонала таких закономерностей не отмечено. Наблюдаемые различия возможно объяснить процессами «селекции» аллелей Val, поскольку наличие этих аллелей, по-видимому, существенно снижает адаптивные возможности человека к экстремальным условиям нефтепромыслов севера Западной Сибири.

Таблица 1

Число работающих на нефтепромыслах с

различными аллельными вариантами гена CYP1A1  в зависимости от стажа работы

Полученное нами распределение частоты встречаемости различных генотипов CYP1A1 среди обследованных несколько отличается от  данных приведенных другими исследователями для популяций европеоидов, это, по нашему мнению, обусловлено  тем, что в анализируемой выборке рабочих-нефтяников очень велико присутствие метисов. Генеалогический анализ свидетельствует, что среди рабочих-нефтяников 67,8% имеют метисное происхождение, чаще всего (европеоид/монголоид), а, согласно имеющихся литературных данных, в популяциях монголоидов частота аллеля Val значительно выше чем среди европеоидов.  В выборке административно-хозяйственного персонала частота метисов была существенно ниже (34,2%).

Таблица 2

Число эпителиоцитов с микроядрами в осадке мочи у лиц, работающих на нефтепромыслах (в %)

Звездочками отмечены значения достоверно отличающиеся от контроля: одной при p>0,01; двумя при   p>0,05.

Полученные данные свидетельствуют (табл. 2.), что у рабочих-нефтяников по сравнению с контролем  повышен уровень эпителиоцитов с микроядрами в мочевыводящих путях.

Известно, что микроядра образуются, в основном, в результате отставания отдельных хромосом или ацентрических фрагментов хромосом при делении клеток. Согласно микроядерного теста самые высокие показатели наблюдались у лиц гомозиготных (Val/Val) или гетерозиготных по мутации (Ile/Val) гена CYP1A1.  Показано, что именно в этой группе лиц особенно высок уровень бенз(а)пирена  в моче  (табл. 3.), что свидетельствует о сниженной активности в деятельности ферментов биотрансформации полиароматических углеводородов при наличии у человека аллеля гена Val.

Таблица 3

Уровень бенз(а)пирена в моче у лиц, работающих на нефтепромыслах

(в  ng/L)

Значения достоверно отличающиеся от контроля отмечены звездочкой, а при низком стаже достоверные отличия показателей наблюдаемых у лиц с высоким стажем отмечены чертой: одной при p>0,01; двумя при   p>0,05.

Поскольку полиароматические углеводороды, в частности бенз(а)пирен присутствуют в табачном дыме (Crespi et al., 1991), нами был проведен анализ наличия регистрируемых изменений у курильщиков и лиц не злоупотребляющих курением. Число курящих среди рабочих-нефтяников составило 56,9%, а среди административно-хозяйственного персонала – 52,6%. Установлено, что частота клеток с микроядрами была на 15-18% выше у лиц выкуриваюших в день больше 10 сигарет и на 4-8% у тех которые выкуривали менее 5 сигарет, чем это отмечено в группе некурящих рабочих-нефтяников. Такая же закономерность отмечена для  административно-хозяйственного персонала. При этом в обоих случаях более существенные нарушения отмечены у лиц в генотипе которых присутствовал аллель Val  гена CYP1A1.

       Цитохром Р4501А1 (CYP1A1), принимает участие в первом этапе метаболизма полициклических ароматических углеводородов. Данный ген содержит четыре полиморфных сайта, два из которых приводят к аминокислотным заменам (изолейцин/валин) в кодируемом белке (Зборовская, Чижиков,  2003).

Исследования, проведенные в группах лиц, подвергающихся воздействию полиароматических углеводородов показали, что гетерозиготный генотип гена CYP1A1 ассоциирован с повышением частоты хромосомных аберраций, при этом было обнаружено достоверное возрастание уровня метаболитов полиароматических углеводородов в моче у носителей  аллеля Val  (Zhang et al., 1996).  Показано, что при высоком содержании бенз(а)пирена в моче наблюдается повышенное число клеток с анеуплоидией по  определенным хромосомам кариотипа. При этом отмечена линейная зависимость, чем выше содержание полиароматических углеводородов, тем большее число  клеток имело измененное число хромосом. Имеющиеся данные позволяют сделать вывод, что компоненты и метаболиты  нефти,  могут также индуцировать микроядра в клетках человека и при этом микроядра формируются как за счет анеугенеза, так и кластогенеза (Yager et al., 1990).

Известно, что повышенное содержание в окружающей среде токсических производных нефти,  может приводить к иммуносупрессии из-за повреждения ДНК и снижения выживания иммунокомпетентных клеток (Kuner, Wu, 2002). Ранее нами было показано, что поражение цитогенетического аппарата приводит к иммуносупрессивному состоянию и дисфункциональным изменениям Т-лимфоцитов, а это, в свою очередь, снижает возможности иммунной системы  организма осуществлять контроль за генетическим гомеостазом организма и способствует накоплению цитогенетически измененных клеток (Ильинских с соавт., 1986). Поэтому  повышение числа цитогенетически аномальных клеток может быть следствием как прямого, так и опосредованного действия генотоксических компонентов нефти.

Полученные нами данные свидетельствуют о возрастании числа клеток с микроядрами у курильщиков. Повышение числа эпителиоцитов с микроядрами в полости рта у курильщиков показали  Wu P. et al. (2004), при этом они установили, что чем большее число сигарет выкуривал человек и длительнее «стаж» курильщика, тем большее число клеток имело микроядра. Tomani et al. (1991) наблюдали полиморфизм частоты клеток с микроядрами в зависимости от возраста курильщика. Такой закономерностей нами не было зарегистрировано. 

Таким образом повышенная мутагенная чувствительность к действию условий нефтедобычи для рабочих-нефтяников имеющих мутантные аллели Val гена CYP1A1 является неблагоприятным прогностическим признаком для стабильности генетического аппарата рабочих нефтепромыслов, поскольку может свидетельствовать о начале малигнизации в урогенитальном тракте человека (Ильинских с соавт., 2003; Григорьева, 2007).

Наблюдаемое повышение уровня цитогенетических нарушений  при наличии у человека аллеля Val,   может быть  связано не только с присутствием в организме рабочих бенз(а)пирена, но, возможно, и   влиянием   некоторых экстремальных факторов севера Западной Сибири, которые могут оказывать как мутагенное, так и ко-мутагенное действие на генетический аппарат человека. Помимо антропогенных факторов это и природные особенности Севера: низкие температуры, высокая интенсивность космического излучения, мощные геомагнитные поля авроральной зоны, особенности светового режима (полярные ночь и день) и дефицит некоторых жизненно важных микроэлементов ( Собакин, 2004).

Таким образом установлено повышение числа эпителиоцитов с микроядрами и уровня бенз(а)пирена в моче рабочих нефтепромыслов севера Западной Сибири. Особенно существенные изменения по регистрируемым показателям были у лиц, имеющих мутантные аллели Val гена CYP1A1. Повышенный уровень мутационного процесса, выявленный при обследовании рабочих-нефтяников, является, по-видимому, результатом суммарного действия различных факторов на геном. При этом речь идет не только о воздействии заведомых мутагенов, но и факторов  ко-мутагенной  природы. Результаты исследования позволяют сделать также вывод о настоятельной необходимости введения новых научно-обоснованных критериев отбора на нефтепромыслах севера Западной Сибири персонала рабочих, имеющих повышенную резистентность к действию генотоксикантов углеводородного происхождения, существенную роль в «селекции» такого рода могут сыграть данные генотипирования.

Настоящая работа проведена при финансовой поддержке гранта РГНФ № 13-06-00094