|
Сибирский государственный медицинский университет (г.Томск)
Проведен иммунофлюоресцентный анализ антигенов вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в теле марит описторхисов. Установлено, что антигены ВЭБ локализованы в яицах марит гельминтов. Введение антигенов описторхисов в культуры лимфоцитов здоровых доноров вызывает появление цитогенетических нарушений, однако структурные аберрации хромосом способны были индуцировать только антигены полученные из яиц. Аналогичные изменения в культурах вызывало и заражение культур клеток ВЭБ. Обсуждается роль локализации ВЭБ в яицах марит описторхисов в распространении этого вируса, а также в генетической и онкопатологии.
Установлено, что описторхозная инвазия сопровождается значительным увеличением числа клеток с цитогенетическими нарушениями (Ильинских и др., 1984). Поскольку описторхис не может непосредственно воздействовать на генетический аппарат клеток организма, возникает обоснованное предположение, что цитогенетические поражения, наблюдаемые при описторхозной инвазии, обусловлены опосредованными механизмами. Наши исследования (Ilyinskikh et al., 1998) позволили установить, что дериваты из различных частей марит описторхисов обладают не одинаковой способностью индуцировать цитогенетические нарушения в условиях культуры клеток человека. Было высказано предположение, что мутагенной активностью обладает ассоциированный с гельминтом инфекционный агент. Поскольку фильтрация дериватов из тела марит описторхисов не снижала способности индуцировать мутации, то закономерно возникло предположение, что в маритах присутствует вирусный агент. Известно, что способностью индуцировать цитогенетические нарушения обладают вирусы (Nichols et al., 1993; Ильинских и др., 1984). Имеются литературные данные, согласно которым описторхис может
находиться в ассоциации с вирусом простого герпеса (Иванских, Близнюк, 1986). В связи с этим, обращают на себя внимание результаты исследований, представленные Ильиным (1992), свидетельствующие о том, что у жителей населенных пунктов расположенных в бассеинах рек Обь, Иртыш и Томь, где пораженность описторхозом местного населения достигает 86,5% (Генецинская, Добровольский, 1978) наблюдается усиление циркуляции потенциально онкогенного вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), также относящегося к семейству герпесвирусов. При этом эпидемиологические исследования предпринятые нами в Обь-Томь-Иртышском речном бассеине показали (Ilyinskikh et al., 1999), что высокий уровень цитогенетически измененных клеток особенно часто отмечается в тех населенных пунктах, где имеется повышенная инвазированность описторхозом и усиление перситенции ВЭБ. В связи с этим возникает закономерное предположение, что ВЭБ может играть существенную роль в цитогенетических последствиях описторхозной инвазии. Результаты исследований в этом направлении, по-видимому, могут позволить внести некоторые коррективы в существующие представления о патогенезе описторхоза.
Цель настоящей работы - изучить возможность ассоциации вируса ЭБ с маритами описторхисов и роль вируса ЭБ в индукции цитогенетических нарушений, наблюдаемых при описторхозной инвазии
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Цитогенетический и анализ хромосом человека проводили в культурах Т-лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению фитогемагглютинином по стандартной методике (Прокофьева-Бельговская, 1969). Культуры получали от 6 здоровых людей, серонегативных к вирусу Эпштейна-Барр. Половину приготовленных для культивирования образцов предварительно заражали вирусом Эпштейна-Барр путем введения в культуру Т-лимфоцитов суспензионной вируспродуцирующей линии P3HR-1 в количестве 25 тыс. клеток на 1 мл культуры. Вирус был получен в лаборатории онковирусологии НИИ онкологии Томского Научного Центра СО РАМН. Через 24 часа после начала культивирования в питательную среду вводили антигены марит описторхисов, извлеченных из печени трупов людей, умерших от острого нарушения мозгового кровообращения.
В эксперименте использовалось два антигена, полученных из марит описторхисов: соматический и яичный (Котелкин и др., 1997). Неповрежденных гельминтов трехкратно промывали в растворе Хэнкса, содержащем фунгизон (2мкг/мл), пенициллин и стрептомицин (200 мкг/мл). Паразитов помещали в среду ДМЕМ(М), производства НПО “Вектор”, и культивировали в течение 2 нед при 370С. Культуральную среду центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин с целью получения осадка, содержавшего яйца Opisthorchis felineus. Яичный антиген получали путем трехкратной гомогенизации замороженного осадка, затем суспензию 3 раза обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин при 40С в 5мМ Трис-HCl буфере, рН 7,0. Соматический антиген получали из гомогената гельминтов (прошедших стадию культивирования и не содержащих яиц), замороженных в жидком азоте в 5 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,0, а затем трижды обработанного ультразвуком при 40С в течение 1 мин. Все препараты антигенов хранили при -400С в обезвоженном состоянии. В антигенах определяли содержание белка по методу Lowry et al. (1951) (0,5 мг/мл) и вносили в зараженные и незараженные вирусом Эпштейна-Барр культуры лейкоцитов по 0,1 мл антигена на 2 мл культуральной среды (2,5*10-8 кг белка/мл). Через 72 часа после начала культивирования проводилось цитогенетическое изучение клеток культуры.
У каждом варианте опытной культуры и в контроле изучено стандартным рутинным методом (Прокофьева-Бельговская, 1969) не менее 100 метафаз, при этом регистрировали как структурные аберраций, так и изменения в числе хромосом.
Проведено иммунофлюоресцентное выявление антигена ВЭБ в лимфоидных и эпителиальных клетках людей инвазированных Opisthorchis felineus, а также в теле марит описторхисов, выделенных из желчных протоков человека. Во всех случаях использован стандарный метод изложенный Иванниковой с соавт. (1987) в модификации Иванских и Близнюк (1996).
Изучена жизнеспособность и вылупляемость мирацидиев из яиц O. felineus, выделенных при дуоденальных зондированиях больных описторхозом, методом описанным Беэр с соавт. (1991).
При статистической обработке результатов использованы критерии Стьюдента и метод ранговой корреляции Спирмена (Лакин, 1980).
Полученные данные свидетельствуют (табл. 1), что при введении в культуры Т-лимфоцитов соматических антигенов описторхиса увеличения числа клеток со структурными нарушениями хромосом не происходило (в опыте - 1,2±0,5 при 0,9+_0,3% в контроле; P>0,05). При этом отмечено увеличение числа клеток с гипоплоидным и гиперплоидным кариотипом (соответственно 2,9+_0,4 и 0,7+_0,2 при 1,4+_0,3 и 0,1+_0,1% в контроле, в обоих случаях Р<0,01). В то же время, антигены, полученные из из яиц марит O. felineus обладали способностью к повышению числа клеток со структурными нарушениями хромосом. При этом возрастает число клеток с разрывами и обменами хромосом ( в обоих случаях Р<0,01). Кроме того зарегистрировано увеличение числа полиплоидных клеток (2,3±0,4 при 0,2±0,1% в контроле; P<0,01). Установлено, что введение в культуру ВЭБ (без введения антигенов O. felineus) индуцировало в культуре существенное увеличение числа клеток со структурными нарушениями хромосом (8,0±0,4, при 0,9±0,3% в контроле; P<0,01), без возрастания числа клеток с анеуплоидией (P>0,05), но с увеличением числа клеток с полиплоидным хромосомным набором (Р<0,01). Заражение культуры лимфоцитов ВЭБ на фоне введения соматических антигенов O. felineus не изменяет настоящей картины в отношении числа клеток со структурными нарушениями хромосом и клеток с полиплоидным кариотипом, однако наряду с этим отмечено достоверное повышение числа клеток с гипоплоидным и гиперплоидным кариотипом ( в обоих случаях Р<0,01). Установлено, что особенно существенные поражения в струкутре и числе Т-лимфоцитов крови отмечается при заражении культуры ВЭБ на фоне введения антигенов яиц марит описторхисов. Так общее число цитогенетически измененных клеток достигает 41,5±5,3%, при 2,4±0,4% в интактном контроле (P<0,01). Среди структурных нарушений особенно часто наблюдались клетки с хроматидными аберрациями и обменами хромосом, одновременно регистрировались клетки с гипо- гиперплоидным и полиплоидным хромосомными наборами. Отмечено появление клеток с пульверизацией всех хромосом лимфоцита.
Гомогенаты тел марит описторхисов были изучены на предмет содержания в них капсидного антигена вируса Эпштейна-Барр с использованием непрямой реакции иммунофлюоресценции. Описторхисы были получены при дуоденальном зондировании больных описторхозом. Анализ интенсивности свечения, выраженный в баллах свидетельствует о присутствии антигена ВЭБ в большинстве выделенных яиц описторхисов (табл. 2)
При этом было установлено, что жизнеспособность яиц находится в достоверной обратнопропорциональной зависимости от интенсивности свечения антигена в яицах паразита.
Интактные яица описторхисов помещали в специальную среду способствующую вылуплению мирацидиев и далее проводили иммунофлюоресцентный анализ на присутствие в яицах и мирацидиях антигенов ВЭБ. Анализ иммунофлюоресценции свидетельствует, что антигены ВЭБ находяться не на поверхности яицевых оболочек яица, а присутствуют в теле мирацидия. Кроме того,было установлено что, чем выше интенсивность свечения мирацидия, тем менее выражены движения личинки, при этом уже через 10-20 мин после вылупления движения в этих случаях прекращались. Мирацидии лишенные антигена ВЭБ во всех случаях интенсивно передвигались в течение 30-45 мин.
Таким образом полученные данные свидетельствуют, что вирус ЭБ способен вызывать структурные аберрации хромосом в условиях культуры лимфоцитов человека. Практически аналогичные данные зарегистрированы и в случае введения в культуры яичного антигена. Соматический антиген таким действием не обладал. Мы склонны рассматривать эти данные в пользу вывода о способности ВЭБ, присуствующего в яичном антигене индуцировать структурные аберрации хромосом в культурах клеткок человека. Имеются косвенные доказательства тому, что антигены ВЭБ могут присутствовать в яицах описторхисов. Так установлено, что среди ранних вирусных полипептидов имеются следующие классы: 135, 78, 50, 47, 44, 36, 35, 33, 32 и 18 кД (Hummel M., Kieff E., 1979; Дьяченко, 1984). В то же время анализ антигенов O. felineus показывает, что полипептиды классов 50, 44, 33 и 32 присутствуют и в яицах описторхиса (Котелкин и др., 1998). Полипептиды 50 и 33 кД вообще характерны и для других трематод: Clonorchis sinensis (S.I.Kim, 1994) и Paragonimus westermani (K.H.Joo et al., 1989) Известна способность некоторых вирусов использовать полипептиды клетки хозяина в процессе репликации, кроме того имеются данные свидетельствующие о том, что ВЭБ способен захватывать генетический материал клеток хозяина и продуцировать белки, не характерные для ВЭБ ( В.М.Жданов, 1990).
Интересно отметить, что введение вируса герпеса, золотистым хомякам, инвазированным описторхисами, вызывает у паразитов резкое снижение продукции яиц и сперматозоидов с индукцией симпластов в генеративных органах паразита (Иванских, Близнюк, 1996). Согласно данным настоящей работы, наличие антигена вируса ЭБ, также относящегося к группе вирусов герпеса, способствует уменьшению жизнеспособности яиц и снижает двигательную активность мирацидиев при их вылуплении из яица.
Полученные данные относительно локализации антигена ВЭБ в яицах описторхисов, возможно, по-видимому, интерпретировать с точки зрения целесообразности этой ассоциации для жизнедеятельности обоих паразитов. С одной стороны, вирус, попадая в тело описторхиса, становиться относительно неуязвимым к противовирусному иммунитету организма хозяина. Если ВЭБ способен, в этой ситуации, к трансфазовой передаче, т.е. сохраняться в личиночных стадиях развития описторхиса (мирацидий, спороцисты, редии, церкарии и метацеркарии), то, не исключается, возможность попадания этого вируса, вместе с метацеркариями описторхисов в организм человека. Заражение человека описторхисами, в свою очередь, ведет к, увеличению числа В-лимфоцитов (Лепехин и др., 1992), в которых, как известно (Дьяченко, 1984) этот вирус способен активно репродуцироваться. С другой стороны, вирусная инфекция индуцирует в иммунокомпетентных клетках хозяина генетические аномалии и это
способствует усугублению иммунодефицитного состояния (Ильинских и др., 1986), что, в свою очередь, снижает как противогельминтный, так и противовирусный иммунитет (Ильинских и др., 1984). Поскольку вирус Эпштейна-Барр является одним из основных потенциально онкогенных вирусов человека (Дьяченко, 1984), то представляют несомненный интерес исследования направленные на выяснение роли этого вируса в развитии рака печени и желчных протоков, характерных для описторхозной инвазии человека (Лепехин и др., 1992).
Таблица 1
Нарушения в
структуре и числе хромосом в культурах Т-лимфоцитов здоровых доноров зараженных вирусом ЭБ на
фоне введения антигенов из марит описторхисов
|
Регистрируемый показатель
|
Не зараженные ВЭБ
культуры
лимфоцитов
|
Зараженные ВЭБ
культуры
лимфоцитов
|
|
|
Интакт-
ные(кон-
троль)
|
После
введения
сомати-
ческого антигена
O.
felineus
|
После
введения
антигена
из яиц
O.
felineus
|
Без вве-
дения
антиге-
из
O.
felineus
|
С вве-
дением
сомати-
ческого антигена
O.
felineus
|
С вве-
дением
антигена
из яиц
O.
felineus
|
|
Клеток со со структурными
аберрациями
|
0,9±0,3
|
1,2±0,5
|
7,9±0,5*
|
8,0±0,4*
|
8,5±1,9*
|
28,1±5,6*
|
|
с хроматидными
|
0,5±0,2
|
0,8±0,3
|
3,9±0,5*
|
4,5±0,2*
|
4,8±0,6**
|
16,8±2,1*
|
|
с хромосомными
|
0,3±0,2
|
0,3±0,1
|
1,1±0,1*
|
1,3±0,1*
|
1,7±0,3*
|
2,6±0,8*
|
|
с обменами
|
0,1±0,1
|
0,1±0,1
|
2,9±0,3*
|
2,2±0,1*
|
2,2±0,4*
|
8,4±1,7*
|
|
Клеток с
измененным
числом
хромосом
|
1,6±0,5
|
2,5±0,5
|
3,6±0,7*
|
5,8±0,5*
|
6,7±0,9*
|
15,1±3,4*
|
|
с гипоплоидией
|
1,4±0,3
|
2,9±0,4*
|
1,6±0,4
|
2,5±0,4
|
2,8±0,7**
|
7,3±1,1*
|
|
с гиперплоидией
|
0,1±0,1
|
0,7±0,2*
|
0,2±0,1
|
0,5±0,2
|
1,2±0,3*
|
3,7±0,5**
|
|
с полиплоидией
|
0,2±0,1
|
2,3±0,4*
|
2,3±0,4*
|
2,3±0,2*
|
2,7±0,3*
|
4,2±0,9*
|
|
Всего
клеток с цито-
генетическими
нарушениями
|
2,4±0,4
|
3,5±0,7
|
12,5±0,6*
|
13,2±1,6*
|
12,8±2,4**
|
41,5±5,3*
|
Примечание: Достоверные отличия от интактного контроля
отмечены звездочками: *P<0,01; **P<0,05
Таблица 2
Число яиц с
антигенами ВЭБ и их жизнеспособность в дуоденальном содержимом у больных
хроническим описторхозом.
|
Больной
|
Число яиц (в%) с различной степенью иммунофлюоресценции
в непрямой РИФ, выраженной в баллах
|
Число нежизнеспособных яиц (в %)
|
|
|
0
|
1
|
2
|
3
|
4
|
Индекс
|
|
|
1
|
2
|
1
|
5
|
10
|
82
|
0,8
|
41,6
|
|
2
|
5
|
3
|
20
|
8
|
64
|
0,6
|
29,3
|
|
3
|
4
|
4
|
9
|
11
|
72
|
0,7
|
36,3
|
|
4
|
6
|
1
|
30
|
29
|
34
|
0,4
|
19,5
|
|
5
|
4
|
5
|
10
|
12
|
69
|
0,7
|
32,1
|
|
6
|
7
|
7
|
10
|
4
|
72
|
0,7
|
31,5
|
|
7
|
3
|
4
|
1
|
1
|
91
|
0,9
|
48,6
|
|
8
|
5
|
6
|
30
|
25
|
34
|
0,3
|
16,3
|
|
9
|
2
|
2
|
41
|
29
|
26
|
0,3
|
15,2
|
|
10
|
6
|
6
|
10
|
12
|
66
|
0,7
|
35,4
|
ЛИТЕРАТУРА
Беэр С.А., Герман С.М., Дитрих О., Гибода М. Морфофункциональные особенности ультраструктуры внешней оболочки яиц описторхид. Сообщение 1. Вылупление мирацидиев. // Мед паразитол. 1991. - № 2. - С. 18-22.
Генецинская Т.А., Добровольский А.А. // Частная паразитология. - М., Высшая школа. - 1978. - 292 с.
Дьяченко А.Г. Структурная организация генома вируса Эпштейна-Барр. // Экспер. онкология. - 1984. - Т. 6, №4. - С. 3-9.
Жданов В.М. // Эволюция вирусов. М., Медицина. - 1990. - 374 с.
Иванникова Т.А., Королев М.Б., Фролова М.П., Чунихин С.П. Иммунофлюоресцентное выявление вирусных антигенов при ферментативной обработке гистологического и цитологического материала. // Вопр. вирусол. - 1987. - №3. - С.373-377.
Иванских В.И., Близнюк В.В. Влияние описторхисов на проявление вирусов герпеса второго типа в эксперименте и их возможное участие в механизме возникновения первичного рака печени. // Мед. паразитол. -1996. - №2. - С. 23-26.
Ильин С.Ю. Роль вируса Эпштейна-Барр в цитогенетических изменениях клеток крови у людей. // Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Томск, - 1995. - 15 c.
Ильинских Н.Н., Ильинских И.Н., Бочаров Е.Ф. // Инфекционный мутагенез. - Новосибирск, Наука. - 1984. - 194 с.
Ильинских Н.Н., Бочаров Е.Ф., Ильинских И.Н. // Цитогенетический гомеостаз и иммунитет. - Новосибирск, Наука. - 1986. - 268 с.
Котелкин А.Т., Разумов И.А., Локтев В.Б. Полипептидный состав основных антигенов и выявление доминирующих иммуногенных белков Opisthorchis felineus. // Вестн. РАМН. - 1998. - Вып. 4. - С. 29-34.
Котелкин А.Т., Разумов И.А., Покровский И.В., Локтев В.Б. Сравнительное изучение соматического, экскреторно-секреторного и яичного антигенов Opisthorchis felineus. // Мед. парзитол., 1997. - №1. - С. 12-16.
Лакин Г.Ф. // Биометрия. - М., Высшая школа. - 1980. - 294 с.
Лепехин А.В., Мефодиев В.В., Филатов В.Г. // Эпидемиология и лечение описторхоза. Томск, Томский университет. - 1992. - 186 с.
Прокофьева-Бельговская А.А. // Основы цитогенетики человека. М., Медицина. - 1969. - 486 с.
Hummel M., Kieff E. Mapping of polypeptides encoded by the Epstein-Barr virus genome in productive infection. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 79, №1. - P. 5608-5702.
Ilyinskikh E.N. , Novitskiy V.V., Urazova L.N., Isayeva T.M., Ilyinskikh I.N., Ilyinskikh N.N. Assessment of the relationship of chronic opisthorchiasis to Epstein-Barr virus infection as well as some cytogenetical and immunological parameters in two comparable Siberian regions. // Environ. Toxicol. - 1999. -Vol. 14, №4. - C. 414-424.
Ilyinskikh E.N., Lepyekhin A.V., Logvinov S.V., Ilyinskikh N.N. Estimation of the mutagenic potential of the trematode Opisthorchis felineus in experimentally infected guinea pigs. // Parasitology Research. 1989. - Vol. 84, №7. - P. 570-572.
Joo K.H., Ahn H., Chung M.S., Rim H.J. Demonstration of specific and cross reactive components of Paragonimus westermani crude antigen by EITB. // Kisaengchunghak Chapchi. - 1989. - Vol. 27, №1. - P. 9-14.
Kim S.I. Immune reactions between excretory-secretory antigen and specific antibodies of Clonorchis sinensis before after praziquantel treatgment in experimentally infected rabbits. // Korean J. Parasitol. - 1994. - Vol. 32, № 1. - P. 35-42.
Lowry H.O. , Rosenbrough H.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.193, №2. - P.265-275.
Nichols W.W. Relationships of viruses, chromosomes and carcinogenesis. // Hereditas. - 1963. - Vol. 50, №1. - P. 53-80
|
