Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Institut fur Molekulare Medizin und Zellforschung, Freiburg, Germany

Белки клеточных мембран играют ключевую роль в передаче клеточных сигналов, клеточной адгезии и транспорте ионов, а также служат основными мишенями для действия лекарственных средств.
Целью данной работы, осуществленной на базе Institut fur Molekulare Medizin und Zellforschung (Фрейбург, Германия) в рамках сотрудничества с кафедрой биохимии и молекулярной биологии СибГМУ, являлось маркирование, выделение и сравнение мембранных белков опухолевых клеток с различной экспрессией катепсина B.
Катепсин B относится к лизосомальным цистеиновым пептидазам и экспрессируется во всех тканях млекопитающих [5]. Этот фермент локализован главным образом в субклеточных лизосомальных компартментах, где он осуществляет свои протеолитические функции. Однако в последнее время появилось множество свидетельств о наличии у катепсина B специфических внеклеточных функций. Кроме того, было установлено, что катепсин B играет важную роль в опухолевом росте и метастазировании [2–4]. Так, было показано, что катепсин B, ассоциированный с клеточной мембраной раковых клеток, участвует в протеолизе белков межклеточного пространства в здоровых тканях, окружающих опухоль. Наибольшая активность катепсина B отмечалась по периферии опухоли, что способствует ее агрессивному росту и метастазированию [3,4]. Опухоли с повышенной экспрессией катепсина B отличаются агрессивным ростом и повышенным риском метастазирования, тогда как дефицит катепсина B, напротив, приводит к уменьшению прогрессии раковых опухолей. Понимание того, как катепсин B влияет на состав белков клеточной мембраны опухолевых клеток, позволит прояснить роль данного фермента в развитии раковых опухолей. В связи с этим целью проведенных исследований являлось сравнение качественного и количественного составов мембранных белков раковых клеток с различной экспрессией катепсина B.
Мембранные белки были маркированы и выделены нами из фибробластов и раковых клеток PyMT экспериментальной модели опухоли молочной железы у трансгенных мышей [1]. Раковые клетки и фибробласты отличались генотипами по катепсину B (+/+, +/-, -/-) и, соответственно, имели различную степень экспрессии данного фермента. Маркирование биотином, выделение и очистка мембранных белков были осуществлены с помощью набора Cell Surface Protein Biotinylation and Purification Kit («Pierce»; Rockford, IL, USA). Кроме того, было проведено сравнение эффективности метода очистки данным набором с методикой очистки с помощью Dynabeads M-280 Streptavidin («DYNAL»; Oslo, Norway), а также подобраны оптимальные условия для выделения мембранных белков раковых клеток. Далее было проведено сравнение качественного и количественного составов выделенных мембранных белков раковых клеток с различной экспрессией катепсина B.
Детальный протеомный анализ, включающий электрофорез в градиентном полиакриламидном геле, вестерн-блоттинг и современный метод маркирования белков CyDye DIGE флюоресцирующими метками с последующей регистрацией с помощью сканера Typhoon 9410 Variable Mode Imager («Amersham Biosciences»; England), позволил выявить специфические отличия в сравниваемых составах мембранных белков раковых клеток. Отличающиеся белковые фракции были обнаружены и измерены с высокой степенью точности. Зарегистрированные отличия свидетельствуют о том, что отсутствие экспрессии катепсина B значимо изменяет качественный и количественный составы мембранных белков как раковых клеток, так и фибробластов.
Отличающиеся фракции мембранных белков раковых клеток после сравнения были отправлены на дальнейшее исследование и идентификацию с помощью масс-спектрометрии. Это позволит определить мишени для дальнейших исследований и выяснить роль катепсина B в развитии раковых опухолей и других патологических состояний.

Список литературы:
1. Animal model. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases / E. Y. Lin, J. G. Jones, P. Li et al // American Journal of Pathology. – 2003. – Vol. 163, N 5. – P. 2113–2126.
2. Cathepsin B and D are localized at the surface of human breast cancer cells / M. Sameni, E. Elliot, G. Ziegler et al // Pathol Oncol Res. – 1995. – Vol. 1, N 1. – P. 43–53.
3. Cathepsin B and tumor proteolysis: contribution of the tumor microenvironment / B. F. Sloane, S. Yan, I. Podgorski et al. / Seminars in Cancer Biology. – 2005. – N 15. – P. 149–157.
4. Roshy, S. Pericellular cathepsin B and malignant progression / S. Roshy, B. F.Sloane, K. Moin // Cancer and Metastasis Reviews. – 2003. – Vol. 22. – P. 271–286.
5. Turk, V. Lysosomal cysteine proteases: facts and opportunities / V. Turk, B. Turk, D. Turk // Embo J. – 2001. – Vol. 20. – P. 4629–4633.