Шуйский государственный педагогический университет, г.Шуя, Областной онкологический диспансер, г. Владимир

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 3), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Быстрое развитие конфокальной микроскопии привело к  разработке новых  методов обычной световой микроскопии. Одна из первых разработок основывалась на разделении (конволюции) цвета.  С этой целью обычный световой микроскоп  был оснащен телекамерой высокого разрешения, имеющей систему охлаждения и  автоматически двигающуюся платформу для образца.  Микроскоп  регистрирует через телекамеру изображения, полученные в различных фокусных плоскостях, в каждой из которых проходит  конволюция  цветов. Компьютер вычисляет, на основе заданного алгоритма и данного фокусного плана, определенный цвет, математически отсекая цвета с нижележащих  фокусных планов. После такой математической обработки уровень фона резко падает, а предел разрешения повышается.     По качеству,  полученное таким образом изображение не уступает изображениям с конфокального микроскопа, а часто превосходит последние. Данный метод особенно успешно применяется при изучении элементов цитоскелета. Однако его недостатком является длительность математической обработки (от 0,5 часа до суток в зависимости от выбранного алгоритма, типа компьютера и нагрузки на него).
Новой разработкой в области световой микроскопии является многофотонный микроскоп [1].  В нем заложен принцип  конфокального лазерного сканирующего микроскопа, однако изменен механизм формирования изображения, который состоит в следующем. Сверхмощный лазер излучает свет в диапазоне красного цвета, при этом происходит фокусирование и достигается высокая концентрация луча в одной точке образца.  Два фотона красного цвета луча при взаимодействии с молекулой флуорохрома образца выбивает фотон более короткой длины волны (синей, зеленой). Поскольку, концентрация света происходит в очень узкой (в трехмерном пространстве)  точке, то достигается конфокальность изображения. Ниже и выше этой точки концентрация фотонов не достигает критического уровня, поэтому излучение не происходит. Преимуществом микроскопа является возможность изучения глубоких участков ткани (до 1 мм).  Предел разрешения достигает 300 нм.
Новым системным подходом в световой микроскопии явилась, так называемая, 4PI микроскопия, с импульсным гашением световой интерференции [2]. В этой системе образец устанавливается перпендикулярно, между двумя взаимонаправленными объективами, на равном расстоянии от них. Многофотонный свет лазера высокой интенсивности в режиме кратковременной импульсации проходит одновременно через оба объектива, после чего лучи встречаются в одной точке образца с обеих сторон, что существенно снижает ассиметрию линз и повышает предел разрешения микроскопа. При этом возникает интерференция света и вместо одной точки образуется центральное яркое пятно и две тени выше и ниже фокуса.  Тени интерференции убираются импульсом более короткой пульсовой волны перед импульсацией рабочего света.     Важно отметить, что все вышеизложенные методы позволяют исследовать живые клетки тканевых культур.
Технические усовершенствования светового микроскопа позволили исследователям выйти на уровень макромолекул.  Новой разработкой в этой области является резонансный перенос энергии (ФРЭТ).  Этот метод основан на физическом эффекте взаимодействия двух флуорохромов активирующихся разной длиной волны.  При этом, если молекулы этих флуорохромов находятся на расстоянии  большем, чем 60 нм., то каждая световая волна возбуждает флуорохром своего цвета (зеленая – зеленый, красная – красный).  Если молекулы сближаются на расстояние меньшее, чем 60 нм., то фотоны зеленого цвета перескакивают на красный флуорохром, увеличивая его интенсивность, а интенсивность излучения зеленого флуорохрома снижается.  Данный метод может быть использован при изучении, например, молекулярных механизмов транспорта. Для этого два белка метятся разными флуорохромами, а и по сдвигу спектра в красную сторону определяется степень сближения белков. Взаимодействие белков можно подтвердить, если после обесцвечивания лазером флуорохрома красного цвета, повышается интенсивность зеленого.
Технические возможности выявления различных флуорохромов значительно расширились однако, возникает проблема наличия антител, доступных для исследования. Решая эту проблему, можно использовать в качестве детекторов первичных антител протеин А или Fab – фрагменты антител, что дает возможность анализировать до трех кроличьих антител одновременно. Напротив, можно увеличить круг животных, продуцирующих антитела (овца, лошадь, лама), однако этот путь достаточно дорогой. Трехцветное мечение позволяет получить химера, сконструированная методами молекулярной биологии и биотехнологии из ДНК естественного флуорохрома, выделенного из  медузы Aequorea victoria и ДНК изучаемого белка [3]. Возможности изучения живых клеток были существенно расширены с развитием  регистрации оцифрованных изображений, компьютерной обработки серийных срезов и созданием движущих моделей. После разработки специальной платформы для образцов, стал возможен трехмерный анализ изображения, включающий исследование проекций клеточных структур, молекул и др. на микроскопе с добавлением функции времени [4]. Указанная платформа за счет пьезоэлектрического эффекта позволяет получать серию оптических срезов в каждой временной точке, с созданием трехмерной реконструкции в этой временной точке. При четырехмерном анализе добавляются координаты по оси Z [2,4,5,6].  Пятимерный анализ включает исследования двух белков с помощью четырехмерного анализа [5]. Теоретически возможет и, вероятно, будет разработан в ближайшее время шестимерный анализ изображения трех белков в пространстве и времени.
Интересным методическим подходом явились комбинированные (коррелятивные) методы исследований,  сочетающие возможности световой и электронной микроскопии [7]. Они позволяют исследовать динамические клеточные структуры в реальном времени, с последующим изучением их ультраструктуры под электронным микроскопом. Для этого клетки выращиваются не на простом покровном стекле, а на стекле с системой координат, видимых в световом микроскопе. В зависимости от целей эксперимента, выбирается под световым микроскопом нужная клетка, координаты которой регистрируются. Затем клетки заливаются в эпоксидную смолу на том же стекле с системой координат, которая на смоле образует рельефные полосы. По координатам находится нужная нам клетка и режется на ультратонкие срезы, которые могут  так же использоваться для последующего трехмерного анализа.
Новые разработки в области световой микроскопии значительно расширили возможности светового микроскопа и, наряду с методами молекулярной биологии, биотехнологии, иммунологии и др.,  позволяют успешно изучать  молекулярные механизмы функционирования клеток и тканей.

Литература:
1.    Booth M.J., T.Wilson, 2001. Refractive-index-mismatch induced aberrations in single-photon and two-photon microscopy and the use of aberration correction// J. of Biomed. Opt.- 2001.- Vol. 6.- P. 312-317.
2.    Hell S., Stelzer, E.H.K., 1992 b. Fundamental improvement of resolution with a 4 Pi- confocal tluorescense microscope using twu-photon excitation// Opt. Commun. – 1992 b.- Vol.  93. – P. 277-282.
3.    Lippincott – Scwartz J.,N.Cole, and J.Presley.  Unravelling Golgi membrane traffic with green fluorescent protein chimeras// Trends in Cell Biol. -1998, Vol. 8-  P. 16-20.
4.    Martines-Corral, M., Caballero, M.T., Stelzer, E.H.K., Swoger, J. Tailoring the axial shape of the point spread function using the Toraldo concept// Opt. Express. - 2002. – Vol. 10. – P. 98-103.
5.    Martines-Corral M., Caballero, M.T., Pons A. Axial apodization in 4Pi- confocal microscopy by annular binary filters// J.Opt.Soc. Am. A. -  2002 b.- Vol. 19 – P. 1532-1536.
6.    Martines-Corral M., Caballero M.T., Pons A., Andres P. Sidelobe decline in single-photon  4Pi microscopy by Toraldo rings//. Micron.- 2003.- Vol. 34.-P.  319-325.
7.    Polishchuk, R.S. et all. 2000. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi appararus and plasma membrane // J.Cell Biol.- 2000 - Vol.148. – P. 45-58.