Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Кафедра фундаментальных основ клинической медицины

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 69-й научной итоговой студенческой конференции, посвященной 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова (г.Томск, 11-13 мая, 2010 год); под реакцией академика РАМН В.В. Новицкого, член. корр. РАМН Л.М. Огородовой

Посмотреть титульный лист сборника

Скачать сборник целиком (1,4 мб)

 

Актуальность: апоптоз, или программированная гибель клеток (ПГК), представляет собой общебиологический процесс, отвечающий за поддержание клеточного гомеостаза, «архитектуры» многоклеточного организма. Нарушение регуляции апоптоза приводит к развитию различных заболеваний. В частности, показано, что одним из патогенетических аспектов опухолевой трансформации является ингибирование апоптоза. Существует множество сигнальных путей запуска ПГК: как внеклеточных, так и внутриклеточных, регулируемых комплексом биохимических, молекулярных и генетических факторов, большинство из которых полностью еще не изучено. Одними из таких факторов являются активные участники и регуляторы апоптоза – белки теплового шока (heat shock proteins, Hsp). Синтез этих белков возрастает при стрессовом воздействии на клетку. Белки теплового шока выполняют функцию шаперонов. Фолдинг и рефолдинг внутриклеточных белков с помощью Hsp способствует защите клеток от апоптоза, так как  избыточное накопление денатурированных белков приводит к индукции ПГК [1]. Считается, что увеличенная экспрессия белков теплового шока в опухолевых клетках, позволяет им ингибировать апоптоз и оставаться живыми в условиях повышенного стресса. Потенциальная схема ингибирования Hsp, приводящая к деградации белков-клиентов опухолевых клеток, в настоящее время является терапевтически привлекательным направлением в борьбе против онкологических заболеваний.
Цель: оценить этопозид–индуцированный апоптоз опухолевых клеток в условиях ингибирования белка теплового шока 90 in vitro.
Материал и методы: исследования выполнены на клетках линии Jurkat (T– лимфобластоидная линия клеток человека), полученных из Российской коллекции клеточных культур института цитологии РАН (г. Сант-Петербург). Клетки культивировали в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицин (100 мкг/мл)и L – глутамин (0,3 мг/мл) при 37 ºС в атмосфере 5% СО2.  Для индукции апоптоза использовали противоопухолевый препарат – этопозид в концентрации 8 мкг/мл. Роль белка теплового шока 90 исследовали с помощью селективного ингибитора Hsp90 17-аллиламино-17-деметоксигелданамицин (17-AAG) в концентрации 5мкМ. Детекцию апоптоза проводили при помощи набора Annexin V Fitc («Beckman Coulter», США). Метод основан на способности аннексина V специфически связываться с фосфотидилсерином, экспрессированном на внешней цитоплазматической мембране апоптозных клеток, и пропидия иодида (PI) интерколировать с молекулой ДНК. Анализ проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Axiostar plus («Carl Zeiss», Германия).        
Активности каспазы-3 и -8 определяли спектрофотометрическим методом с помощью набора «Abcam» (Великобритания). Метод основан на регистрации активности каспаз при гидролизе синтетических субстратов: DEVD-pNA (для каспазы-3) и IETD-pNA                    (для каспазы-8).                   
Результаты: при культивировании опухолевых клеток в присутствии этопозида, ингибитора Hsp90, а также при их комбинации отмечали достоверное увеличение процента апоптотических клеток по сравнению с интактной культурой. В тоже время, статистически значимых отличий между группами опухолевых клеток, инкубированных с этопозидом и 17-AAG, показано не было. Сочетания данных условий приводило к достоверному повышению числа Fitc-меченных клеток в 3 раза по сравнению с культурами с этопозидом или ингибитором Hsp90 (табл. 1).

Таблица 1

Содержание апоптотических клеток (Me (Q1-Q3))

	Условия инкубации
	Интактные клетки	клетки, инкубированные с этопозидом	клетки, инкубированные с 17-AAG	клетки, инкубированные с этопозидом и 17-AAG
Количество апоптотических клеток, %	1,57 (1,44-1,7)	26,66 (17,88-28,1) р1<0,05	26,82 (26,6-32,1) р1<0,05 р2>0,05	84,1 (80,03-86,92) р1<0,05 р2<0,05 р3<0,05

 

Примечание: р1  – достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями в интактной культуре, p2 – достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями в культуре с добавлением этопозида, р3 - достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями в культуре с добавлением ингибитора белка теплового шока 90.
      Так же маркером апоптоза является увеличение активности эффекторных и инициаторных каспаз. Нами было показано, что активность каспазы-8 и -3 достоверно увеличивалась по сравнению с интактной культурой. Так известно, что повышение экспрессии белка теплового шока Hsp90 подавляет апоптоз, при помощи регулирования активности и стабилизации многих транскрипционных факторов, а также способствует выживанию клеток [2]. Действие ингибитора облегчает проведение смертельного сигнала внутрь клетки и к повышению активности эффекторных каспаз, что неизбежно приводит к увеличению уровня клеток вступивших в апоптоз. Активация апоптоза на фоне блокирования белка теплового шока Hsp90, выполняющего в клетке преимущественно  антиапоптотическую функцию, ведет к значительной активации каспаз, что обуславливает запуск необратимой клеточной смерти.
Вывод: таким образом, полученные результаты указывают на антиапоптотическую роль белка теплового шока 90 в опухолевых клетках линии Jurkat, а применение его ингибитора повышает апоптогенный  эффект этопозида.

 

Список литературы:
1.    Возможные механизмы адаптации клетки к повреждениям, индуцирующим программированную гибель. Связь с патологией / Е.Ю.Москалев, С.Е.Северин // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2006. – №2. – С. 2–16. 
2.    Heat shock proteins: essential proteins for apoptosis regulation / D. Lanneau, M. Brunet, E. Frisan, E. Solary, M. Fontenay, C. Garrido // J. Cell. Mol. Med. – 2008. – Vol. 12, № 3. – Р. 743-761.