Бронхиальная астма (БА) относится к группе мультифакториальных заболеваний, этиология и патогенез которых определяется сложным взаимодействием факторов окружающей среды и генетических факторов. В последние годы большое внимание уделяется генетическому полиморфизму Р2-адренорецепторов (Р 2-АР) [1,2]. Ген р2-адренорецептора человека расположен на длинном плече 5-ой хромосомы. Р 2-АР является членом семейства 7-и трансмембранных рецепторов и состоит из 413-и аминокислот. Появились данные о том, что изменения их аминокислотной последовательности обуславливают изменения функциональных свойств рецептора и могут оказывать существенное влияние на течение БА и определять чувствительность больных к р2-агонистам. Через этот рецептор реализуется расслабление бронхов, а центральным звеном БА является неспособность бронхов к расслаблению. Помимо этого, активация Р2-АР уменьшает выделение слизи, улучшает мукацилиарный клиренс, увеличивает образование сурфактанта альвеолоцитами, препятствует выделению медиаторов воспаления из тучных клеток, базофилов, лимфоцитов, альвеолярных макрофагов, способствует нормализации сосудистой проницаемости, что играет большую роль в патогенезе БА.
Основной клинический интерес относительно полиморфизмов заключается в том, что они могут определять степень процесса "down''-регуляции рецептора в дыхательных путях и таким образом модифицировать бронходилятирующий ответ. Исследования р2-адренорецепторов выявили четыре полиморфизма, в основе которых лежит изменение последовательности аминокислот белка рецептора. Три этих полиморфизма обусловливают изменения функциональных свойств рецептора. Так, замена G 79 позиции от старт-кодона гена Р2-АР на C приводит к замещению 27ой глутаминовой кислоты (Glu) на глутамин (Gln). Это вызывает снижение количества рецепторов на поверхности клетки ("down"-регуляция) после воздействия р2-агониста [2] и способствует развитию бронхиальной гиперреактивности (БГР) [3]. Установлена ассоциация Gln27 с повышенным уровнем IgE в семьях с семейным анамнезом БА и с БГР [3]. Однако результаты других исследований говорят об отсутствии связи полиморфизма 27 аминокислоты Р2-АР с БГР и БА [4]. Несмотря на противоречие полученных данных, можно предполагать участие полиморфизма P2-APB 27 аминокислотной позиции в патогенезе БА и реактивности бронхов.
В настоящее время актуальной проблемой является проведение исследований направленных на установление корреляции выявленного полиморфизма с тяжестью течения бронхиальной астмы. Решение этой проблемы может быть осуществлено на основе методики определения полиморфизмов ПЦР+ПДРФ-анализом (анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов).
В данной работе было проведено обследование 50 детей, больных БА среднетяжелого типа течения, в возрасте от 6 до 14 лет. В контрольную группу входило 20 детей, не имеющих БА в анамнезе. Присутствие полиморфизма Gln27Glu устанавливали методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Исследование функции внешнего дыхания (ФВД) осуществлялось по стандартной методике (анализ кривой «поток-объем» и показателей спирометрии) на установке «Master Lab Pro» («Эрих Иегер», Германия). Для определения степени БГР проводился провокационный тест с метахолином в концентрации 0,0625; 0,25; 1; 4; 8; 16 и 32 мг/мл. Диагностически значимым в отношении БА считался уровень метахолина менее 8 мг/мл, при котором падение объема форсированного выдоха составило более 20% (РС20) - это состояние рассматривалось как наличие БГР.
На первом этапе с помощью программы Primer premier и Disigner PCR была найдена наиболее оптимальная пара праймеров для амплификации: 5'cagccagtgcgctaacct3' и 5'ggcataggcttggttcgt3'. Синтез олигонуклеотидов производился фосфоамитидным методом на ДНК синтезаторе ASM-800 фирмы «Биоссет». Выделение ДНК выполнена согласно протоколу FBI (№27) быстрым фенольным методом с использованием протеиназы-К.
На следующем этапе проводилась полимеразная цепная реакция в автоматических минициклерах «MJ Research» (США) и «ЦиклоТемп 105» (Россия-Австрия). Далее инкубировали при 37°С амплификат с эндорестриктазой Fsp4HI, которая разрезала амплифицированный фрагмент ДНК, если вместо G79 находился C79. Фракционирование производили в 7% полиакриламидном геле при напряжении 10-30 B/см в течении 1 часа. Детекция велась за счет растворенного в буфере бромистого этидия (2мкл на 100мл буфера). Визуализацию проводили под длинноволновым ультрафиолетом (360нм) на цифровой системе BIOTEST-D (Москва).
Для установления влияния полиморфизма на БА был использован метод одномерного дисперсионного анализа. Сила влияния фактора (полиморфизма) на появление БА рассчитывалась по формуле Плохинского. Для оценки различия средних PC20 в попарно несвязанных выборках различных алельных вариантов применялся U-критерий Манна-Уитни. Значения P < 0,05 рассматривали как значимые.
К основным результатам следует отнести то, что ассоциации полиморфизма в 27 аминокислотной позиции р2-адренорецептора с БА среднетяжелого типа течения не установлено ^набл.=2.84 < FKp.=3,3 при a=5%). Вклад этого полиморфизма от всех генетических факторов принимающих участие в развитие БА среднетяжелого типа течения составил 9.3%. Средний уровень метахолина (РС20) в провакационной пробе у носителей гомозиготного варианта р2-адренорецептора Gln27Gln был ниже, чем у носителей гомозиготного варианта Glu27Glu (р=0,038). Гетерозиготы Gln27Glu имели промежуточные значения, не отличающиеся достоверно от гомозигот Gln27Gln и Glu27Glu (р=0,839 ир=0,091 соответстенно). Это говорит об участии полиморфизма 27 аминокислотной позиции р2-адренорецептора в развитии бронхиальной гиперреактивности в случае БА среднетяжелого типа течения, что можно связать с нарушением работы этого рецептора в клетках, вызванного аллельным состоянием Gln27Gln.
Таким образом, полиморфизм в 27 аминокислотной позиции р2-адренорецептора не ассоциирован с бронхиальной астмой среднетяжелого типа течения, однако присутствие глутамина в позиции 27 аминокислоты влияет на показатель бронхиальной гиперреактивности, усиливая его.