Методы культивирования клеток in vitro в настоящее время все более широко применяются для изучения биологических и структурных особенностей клеток, формирующих периретинальные мембраны при пролиферативной витреоретинопатии (ПВР). Преимущество данных методов заключается в том, что только в тканевых культурах можно наблюдать клетки в их живом состоянии, в реальном действии и взаимодействии с микроокружением [1]. В качестве объекта исследования нами выбраны мононуклеары крови, играющие важную роль в патогенезе ПВР. Целью исследования стало изучение характерных морфофункциональных особенностей мононуклеаров в условиях направленного движения жидкости, сходного с движением жидкости в полости глазного яблока [2].
Мононуклеары крови человека были получены методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем растворе фиколла и гипака. Взятая кровь разбавлялась в 2 раза физиологическим раствором. Полученная суспензия наслаивалась на 3 мл смеси фиколла-гипака. Пробы центрифугировали в течение 15 мин при 800g (2000 об/ мин). После центрифугирования интерфазный слой,  содержащий мононуклеары и располагающийся между плазмой и градиентом, забирался пастеровской пипеткой. Добавлялся 1 мл физиологического раствора, и полученная суспензия вновь центрифугировалась в течение 7 мин при 400g (1550 об/ мин) для отмывания полученных мононуклеаров. Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте фиколл-гипак, составила 96%. Для проведения эксперимента нами было разработано устройство, позволяющее in vitro моделировать направленное движение жидкости, сходное с движением жидкости в полости глазного яблока. Устройство представляет собой замкнутую систему с камерой, содержащей 80% среды Мс Coy 5А, 20% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицин. Клеточный материал вводили в камеру и помещали на фильтр. Камера соединялась с емкостью, содержащей питательную среду, через роликовый насос, снабженный поддерживающим клапаном. Благодаря работе роликого насоса в замкнутой системе создавалось равномерное направленное движение питательной среды. Клеточную культуру инкубировали при 37°С в водонасыщенной атмосфере при постоянном движении среды. Спустя 24 чот начала эксперимента культуры мононуклеаров на фильтре были представлены прочно адезированными к субстрату клетками округлой формы, с крупным ядром, иногда с зубчатым впячиванием. Цитоплазма базофильная в виде узкого ободка. Цитохимически в клетках отмечалась высокая активность альфа-нафтилацетатэстеразы, которая блокировалась фторидом натрия. Это соответствует характеристике клеток моноцитарно-макрофагальной линии. Щелочная фосфатаза в культивированных клетках не выявлялась.
Спустя 48 ч от начала эксперимента в описываемых клетках также отмечалась высокая активность альфа-нафтилацетатэстеразы. Однако при проведении реакции с фторидом натрия на фильтре обнаруживались единичные клетки, в которых активность неспецифической эстеразы не подавлялась. Исследование на щелочную фосфатазу в этих клетках выявляло ее умеренную активность. По большинству морфологических параметров (форма клетки, форма и обьем ядра, ядерно-цитоплазматическое отношение) указанные клетки относились к молодым формам фибробластической популяции
Спустя 72 ч от начала эксперимента культуры клеток на фильтре состояли, главным образом, из лимфоцитов и макрофагов с пенистой, содержащей вакуоли цитоплазмой. Ядро почковидной, реже овальной формы, ядерно-цитоплазматическое отношение менее 1. Среди макрофагов и лимфоцитов обнаруживались единичные, крупных размеров, клетки неправильной, преимущественно, веретенообразной формы. Эти клетки были разобщены друг от друга по поверхности фильтра прочими клеточными элементами. Цитохимически в указанных клетках отмечалась высокая активность альфа-нафтилацетатэстеразы, которая не подавлялась фторидом натрия. Активность щелочной фосфатазы в них также была высокой. Морфологически и цитохимически параметры указанных клеток соответствовали активно синтезирующим фибробластам. При исследовании полупроницаемого фильтра, на котором культивировались клетки, в его структурах выявлялись соединительнотканные волокна в виде тонких длинных тяжей.
В процессе культивирования мононуклеаров периферической крови в стандартных условиях были получены следующие результаты. На протяжении всей серии экспериментов (24, 48, 72 ч) клеточная культура на фильтре была представлена клетками округлой формы, с бобовидным, реже овальным ядром и небольшим объемом цитоплазмы. Ядерно-цитоплазматическое отношение около 1. Клетки обнаруживали высокую активность альфа-нафтилацетатэстеразы, которая блокировалась фторидом натрия.
Полученные результаты культивирования мононуклеаров крови in vitro в различных условиях подтверждают предположение о влиянии направленного движения жидкости на морфофункцональное состояние данных клеток и позволяют предложить следующий механизм его реализации.
Под действием различных патогенетических факторов, характер которых определяется основным заболеванием, форменные элементы крови, в том числе и мононуклеары, проникают в стекловидное тело и адгезируются к волокнам его фибриллярного остова. Обладая функциональной полипотентностью, они адаптируются к микросреде, которая накладывает отпечаток на их характеристики [3]. Источником фибробластических клеток, обнаруженных на фильтре при культивировании мононуклеаров крови in vitro в разработанном устройстве, могут быть циркулирующие в крови мезенхимальные клетки различной степени дифференцировки.
Внутриглазная жидкость продуцируется сосудами отростков цилиарного тела, проходит через хрусталик, стекловидное тело, внутренние слои сетчатки и всасывается ретинальными капиллярами. Направленное движение внутриглазной жидкости оказывает физико-химическое воздействие на адгезированные на фибриллах стекловидного тела клетки мононуклеарного ряда, вызывая изменение их метаболизма, что подтверждается результатами эксперимента.
Таким образом, при культивировании мононуклеаров крови in vitro вусловиях направленного движения питательной среды отмечается перестройка их внутриклеточной ферментативной активности. При модулирующем влиянии факторов микроокружения (направленный поток жидкости, внеклеточный матрикс) обнаруживаемые среди мононуклеаров молодые мезенхимальные клетки дифференцируются в зрелые формы, продуцирующие коллеген.
Полученные данные позволили существенно расширить представления о влиянии микроокружения на морфофункциональное состояние мононуклеаров крови и реализацию их фиброгенного потенциала.