Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН, г. Томск
Кафедра биофизики и функциональной диагностики, клинико-диагностическая лаборатория

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 68-й научной итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 20-22 апреля, 2009 год); под реакцией академика РАМН В.В. Новицкого, член. корр. РАМН Л.М. Огородовой

Посмотреть титульный лист сборника

Скачать сборник целиком (1,5 мб)

 

Известно, что при целом ряде патологий, в частности при сахарном диабете, артериальной гипертензии (АГ) наблюдается снижение деформируемости эритроцитов, что усугубляет тяжесть заболевания. Определенный вклад в изменение деформируемости эритроцитов вносят Ca2+-активируемые калиевые каналы (K+ (Ca2+)-каналы) этих клеток [2]. Известно, что K+ (Ca2+)-каналы эритроцитов регулируются несколькими путями. Один из них, как было показано в предыдущих исследованиях, связан с редокс-процессами. Так, установлено, что перекись водорода, вмешивается в регуляцию Са2+-активируемых  калиевых каналов [1]. Известно, что активность протеинкиназы С меняется под действием активных форм кислорода [3, 4].
Таким образом, в связи с важной ролью K+(Ca2+)-каналов в развитии патологических состояний, связанных со структурно-функциональными нарушениями мембраны эритроцитов, изучение особенностей их функционирования и регуляции является весьма актуальным.
В работе использовалась кровь больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа) и кровь практически здоровых доноров. Группу обследуемых больных СД 2 типа составили 7 человек. В контрольную группу вошли 7 практически здоровых доноров. Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ед/мл крови). Процедура получения упакованных эритроцитов: после центрифугирования (1000g, 5 мин, 40С) плазму и клетки белой крови удаляли, а эритроциты дважды промывали 3 частями изоосмотического раствора NaCl (150 мМ), содержащего 5 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,4) при тех же условиях центрифугирования. Для исследования Са2+-активируемых калиевых каналов применен метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора. Добавление кальциевого ионофора А23187 к суспензии клеток приводило к выходу ионов калия и развитию гиперполяризационного ответа эритроцитов. Для оценки активности K+(Ca2+)-каналов эритроцитов измерялись амплитуда гиперполяризационного ответа (ГО) – параметр ?Е. Для активации протеинкиназы С был использован форболовый эфир (РМА – phorbol 12-myristate-13-acetate) в концентрации 10-7 М, который добавлялся в среду инкубации эритроцитов. В ряде экспериментов среда инкубации клеток содержала 1 мкМ перекиси водорода, либо 0,026 М проникающего ингибитора каталазы аминотиразола в присутствии 1 мкМ перекиси водорода.
В первой серии экспериментов исследовалась роль протеинкиназы С в регуляции K+(Ca2+)-каналов эритроцитов здоровых доноров. В присутствии активатора этого фермента PMA (10-7 М) наблюдалось достоверное увеличение амплитуды ГО до -29,5±2,46 мВ (n=7, р<0,05)  по сравнению с контрольным значением -26,68±2,00 мВ. Это свидетельствует об участии протеинкиназы С в регуляции K+(Ca2+)-каналов эритроцитов. Согласно литературным данным способность протеинкиназы С активироваться форболовыми эфирами модулируется активными формами кислорода [3]. В связи с этим изучено совместное влияние перекиси водорода и форболового эфира на активность K+(Ca2+)-каналов эритроцитов. В этом случае исследуемый параметр также увеличивался (?Е = –31,65±1,95 мВ) по сравнению с контрольным значением (n=7, р<0,05). В присутствии только перекиси водорода (1 мкМ) амплитуда ГО также достоверно возрастала и составила -32,58±1,94 мВ (n=7, р<0,05). Таким образом, оказалось, что амплитуда ГО не отличалась от значений, полученных при действии использованных агентов по отдельности.
Для увеличения внутренней концентрации перекиси водорода в ряде экспериментов эритроциты перед добавлением РМА и Н2О2 обрабатывались 0,026 М аминотриазола – проникающим ингибитором каталазы. Амплитуда ГО эритроцитов, обработанных аминотриазолом, достоверно снижалась в присутствии РМА и Н2О2 и соответственно составила -36,19±1,33 мВ и -36,42±1,43 мВ (n=7, р<0,05), тогда как в отсутствие этих агентов параметр ?Е был равен -39,67±2,05 мВ. Совместное действие РМА и Н2О2 также приводило к  достоверному понижению амплитуды ГО эритроцитов и величина параметра ?Е составила -37,56±0,93 мВ (n=7, р<0,05). Полученные результаты можно объяснить тем, что возрастание внутриклеточной концентрации перекиси водорода вследствие ингибиции каталазы изменяло способность протеинкиназы С активироваться форболовыми эфирами.
В группе больных СД 2 типа в сочетании с АГ изменения амплитуды ГО эритроцитов в присутствии РМА и Н2О2 были такими же, как в группе здоровых доноров. Параметр ?Е достоверно повышался от -32,19±4,29 мВ до -40,14±4,62 мВ и -33,16±6,16 мВ соответственно. При совместном действии РМА и Н2О2 его величина составила -33,99±5,6 мВ (n=7, p<0,05), которая была достоверно выше амплитуды ГО эритроцитов в отсутствие использованных агентов. При добавлении аминотриазола в среду инкубации эритроцитов больных картина изменялась: амплитуда ГО в присутствии РМА, Н2О2 и при их совместном действии достоверно повышалась и величина ?Е составила соответственно -40,48±3,51 мВ; -39,09±4,98 мВ; -40,6±4,51 мВ (n=7, р<0,05) по сравнению с контрольным значением (?Е=-34,22±5,38 мВ). Таким образом, у больных СД 2 типа в сочетании с АГ активность K+(Ca2+)-каналов эритроцитов при увеличении внутриклеточной концентрации Н2О2  возрастала, в то время как у здоровых доноров в этих условиях она уменьшалась. Эти изменения, скорее всего, связаны с тем, что у больных СД 2 типа наблюдаются нарушения механизмов регуляции Ca2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов.

Список литературы:
1.    Влияние перекиси водорода на параметры Са 2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов человека / Трубачева О. А., Кремено С. В., Ситожевский А. А., Груздева О. В // Материалы VI Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 50-летию открытия А. М. Уголевым мембранного пищеварения «Механизмы функционирования висцеральных систем». - Санкт-Петербург, 30 сентября- 2 октября 2008 г. – С. 32.
2.    Dunn P. M. The action of blocking agents applied to the inner face of Ca2+–activated K+ channels from human erythrocytes / P. M. Dunn // J. Membr. Biol. – 1998. -  V. 165 (2). – P. 133–143.
3.    Larsson R. Translocation and Enhancement of Phosphotransferase Activity of Protein Kinase C following Exposurein Mouse Epidermal Cells to Oxidants / R. Larsson, P. Cerutti // Cancer research – 1989. – V. 49.- P. 5627-5632.
4.    Vestergaard-Bogind B. Spontaneous inactivation of the Ca2+– sensitive K+ channels of human red cells at high intracellular Ca2+ activity / B. Vestergaard-Bogind // Biochim. et biophys. acta. - 1983. - V. 730. - P. 285-294.