Научный руководитель: канд. биол. наук П.П. Лактионов
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Эта работа была опубликована в cборнике материалов I Всероссийской научной студенческой конференции с международным участием «МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ», под редакцией проф., д-ра мед. наук С.И. Карася (г. Томск, 10-11 ноября 2011 года). 

Введение. Известно, что общий пул циркулирующих ДНК крови формируется клетками различных тканей организма, и в том числе клетками опухолей. Опухолеспецифическая ДНК представляет собой удобный материал для клинической диагностики [1]. Поскольку опухолеспе-цифическую ДНК необходимо выявлять в присутствие «нормальной» ДНК, наиболее удобными ДНК-онкомаркерами являются аберрантно-метилированные CpG-богатые промоторные области генов опухолевой супрессии [2].

Цель работы. Подготовка материала для исследования профиля метилирования ДНК и использование образцов при помощи микрочипов, с последующим детальным анализом профиля метилирования выбранных ДНК-мишеней - перспективных маркеров рака предстательной железы.

Материал и методы. Циркулирующая ДНК крови здоровых доноров (ЗД), больных доброкачественной гиперплазией (ДГПЖ) и больных раком предстательной железы (РПЖ) была выделена, определена ее концентрация методом количественной ПЦР в реальном времени, сконцентрирована и подготовлена для анализа при помощи микрочипов Human CpG island microarray (Corning Life Sciences, Acton, MA), направленных на выявление метилированных ДНК. Эксперименты по анализу образцов ДНК при помощи микрочипов были выполнены Dr. Rene Cortese и др, Centre for Addiction and Mental Health, Toronto, Canada. На основе данных микроэррея нами были выбраны кандидат-ные гены, уровень метилирования CpG-динуклеотидов в которых был определен у каждого пациента при помощи пиросеквенирования (после химичсекой конверсии ДНК) на платформе PSQ 96MA (Pyrosequencing AB, Sweden). Детальный профиль метилирования отдельных молекул промоторной области гена RNF219 был исследован при помощи клонирования ПЦР-продуктов, полученных после химической конверсии ДНК образцов, в pGEM®-T Easy Vector (Promega, USA) и последующего секвенирования ДНК-вставок методом Сенгера.

Результаты и обсуждение. Для последующего анализа были приготовлены образцы циркулирующей ДНК из крови 20 здоровых по медицинским показаниям доноров, 20 больных раком предстательной железы (РПЖ) и 20 больных гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ). Поскольку циркулирующие ДНК сильно фрагментированы, нами был разработан метод осаждения низкомолекулярной ДНК ацетоном в присутствие гликогена. Поскольку известно, что фрагменты ДНК, циркулирующие в крови имеют как тупые, так и выступающие концы, полученные препараты концентрированной ДНК были обработаны T4 DNA polymerase (New England Biolabs, USA) для «тупления» концов ДНК. Адапторы были лигированы при помощи Т4 DNA ligase. После обработки метил-специфичными эндонуклеазами рестрикции и ПЦР в присутствие флуоресцентно меченых трифосфатов образцы были проанализированы при помощи микрочипов. На основании результатов Human CpG island microarray исследования было отобрано 13 фрагментов ДНК с различным уровнем метилирования у здоровых и больных доноров. Анализ результатов пиросеквенирования 13 фрагментов во всех 60 образцах показал достоверные различия в уровнях метилирования CpG-динуклеотидов у ЗД и больных РПЖ в 2-х из 13-ти исследованных фрагментов. Причем в пределах одного фрагмента ДНК присутствуют как цитозины, уровень метилирования которых достоверно различается, так и цитозины со сходным уровнем метилирования у ЗД и больных РПЖ. Для того чтобы выяснить механизм формирования общего пула метилированных ДНК и вклада случайного метилирования было отсе-квенировано не менее чем по 100 клонов от исследуемых пациентов.
Секвенирование отдельных молекул показало, что у здоровых доноров большая часть CpG-динуклеотидов метилирована в исследованном фрагменте гена RNF219. В отличие от здоровых доноров часть циркулирующих в крови больных раком предстательной железы фрагментов данного гена полностью неметилирована. При этом часть молекул имеет профиль метилирования аналогичный тому, который наблюдается в крови здоровых доноров, а молекулы с «промежуточным» типом метилирования отсутствуют. Выводы:
1.    Подготовлены образцы внеклеточной ДНК крови 60 пациентов.
2.    Исследованы различия в уровнях метилирования внеклеточной ДНК здоровых доноров, больных РПЖ и больных ДГПЖ при помощи микрочипов.
3.    По данным пиросеквенирования в пределах одного ДНК-маркера присутствуют как CpG-динуклеотиды с достоверно различающимся уровнем метилирования между здоровыми и больными донорами, так и CpG-динуклеотиды с одинаковым уровнем метилирования
4.    Данные о секвенировании отдельных молекул циркулирующих ДНК методом Сенгера показали, что пул цирулирующей ДНК формируется из здоровых тканей и больных, случайного метилирования нет, а следовательно этот ген может быть использован в диагностике рака предстательной железы.
5.    Обнаруженное деметилирование некоторых позиций CpG-динукле-отидов, по-видимому, принципиально для регуляции экспрессии гена.

Список литературы:
1.    Van der Vaart M., Pretorius P. J. Is the role of circulating DNA as a biomarker of cancer being prematurely overrated? // Clinical Biochemistry. - 2010. - N. 43. - P. 26-36.
2.    Jung K., Fleischacker M., Rabien A., Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker - A critical appraisal of the literature // Clinica Chimica Acta. - 2010. - N. 411. - P. 1611-1624.