Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Лаб. молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 66-й научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 2007 год) под редакцией проф. Новицкого В.В. и д.м.н. Огородовой Л.М.

Скачать сборник целиком (формат .PDF, 1,5 мб)

 

В настоящее время интенсивно изучаются возможности регенераторной медицины, использующей клеточные технологии для восстановления сократительной функции поврежденного миокарда. Считается, что внедрение в кардиологию методов, основанных на трансплантации стволовых клеток, позволит улучшить прогноз многих сердечно-сосудистых заболеваний. Наиболее перспективным считается использование клеточного материала костного мозга – их мононуклеарной фракции и мезенхимальных стволовых клеток. Однако вопрос о выживаемости тех или иных клеток после их трансплантации остается открытым [1, 4].
Целью работы являлось исследование методом клонирования выживаемости стволовых клеток после трансплантации в сердечную мышцу при экспериментальном инфаркте миокарда.
Материал и методы. Работа выполнена на 32 крысах-самцах линии «Вистар» массой 230-250 г. Моделирование инфаркта миокарда (ИМ) было проведено на 26 животных, путём локального охлаждения участка миокарда до температуры жидкого азота металлическим стержнем (S=18,3мм2) [2]. На 9 сутки после криовоздействия животным осуществили интрамиокардиальную трансплантацию клеток костного мозга в область повреждения. Использовали 2 типа клеточного материала: мононуклеарную фракцию (10 животных) и мезенхимальные стволовые клетки (МСК) (10 животных). МСК получали путем культивирования в течение 14 суток мононуклеарной фракции костного мозга, выделенной из бедренных костей крыс. Объём клеточной суспензии, вводимой одному животному составил 250 мкл. В данном объёме содержалось 3х106 мононуклеарных клеток или 3х105 МСК [2,4]. В качестве контрольных групп использовали интактных животных (6) и животных с выполненной деструкцией миокарда без трансплантации клеточного материала (6).
Спустя 30 суток после трансплантации, животных умерщвляли и в стерильных условиях выделяли левый желудочек. После гомогенизации миокарда содержание стволовых клеток изучали методом клонирования полученной взвеси в культуральной среде DIMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, лошадиной сыворотки, антибиотиков и факторов роста. МСК культивировали во флаконах (S=25см2) в СО2–инкубаторе (СО2 5%) при 370С и 100% влажности воздуха. Каждые 5-7 сутки производили смену среды [3]. Спустя 14 суток от начала культивирования питательную среду полностью удаляли, а содержимое флаконов фиксировали и окрашивали гемотоксилин-эозином. В полученных препаратах под микроскопом производили подсчет образовавшихся колоний (круглое или неправильной формы образование содержавшее более 50 клеток) и общую клеточность. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Вилкоксона–Манна–Уитни в пакете прикладных программ Statistica 6.0.
Гибель крыс в группах с моделированием ИМ и последующей трансплантацией клеточного материала составила 25%.
Результаты. В результате проведенных исследований было установлено, что при культивировании гомогената миокарда интактных животных в среде сформировалась 1 колония, а средняя клеточность препаратов составляла 246+/-60 кл/см2; в культуре криоповреждённого миокарда колонии не сформировались, а средняя клеточность этих препаратов составляла 12+/-8 кл/см2. Трансплантация клеточного материала в область экспериментального ИМ существенно изменила эти показатели. При введении мононуклеарной фракции костного мозга количество колоний составляло 3+/-1 при общей клеточности образцов 284+/-92 кл/см2, а при трансплантации МСК было зафиксировано 33+/-7 колоний при общей клеточности 2975+/-84 кл/см2.
Таким образом, спустя 30 суток после проведения трансплантации клеточного материала в инфарктной зоне миокарда обнаруживаются жизнеспособные стволовые клетки. Максимальное количество клеток при культивировании гомогената миокарда наблюдается при проведении трансплантации в область повреждения МСК, которое достоверно превышает как аналогичные показатели в группе контроля, так и в группе с трансплантацией мононуклеарной фракции костного мозга. В тоже время, достоверных различий между контрольными группами (интактные животные и животные с криоповреждением) и группой с введением мононуклеарной фракции не наблюдается.

Список литературы:
46.    Вермель, А.Е. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике / А. Е. Вермель // Клиническая медицина – 2004. - №1. – С. 5-11.
47.    Восстановление сократительной функции криоповрежденного миокарда крыс после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и предифференцированных стромальных стволовых клеток костного мозга / Н. А. Онищенко, И. В. Потапов, Л. В. Башкина. // Бюлл.эксперим.биол.мед. – 2004. – Т. 138, №10. – С. 403-407.
48.    Фармакологическая регуляция функциональной активности стволовых клеток при восстановлении миокарда в постинфарктном периоде / Ставрова Л. А., Фомина Т. И., Плотников М. Б. // Клеточный технологии в биологии и медицине – 2005. - №4. – С. 190-194.
49.    Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда / Шумаков В. И., Казаков Э. Н., Онищенко Н. А. и др. // Российский кардиологический журнал – 2003. – Т. 43, №5. – С. 42-50.