|
Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия (г. Санкт-Петербург)
Эта работа опубликована в сборнике "Науки о человеке": материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2006. – 167 с.
Скачать сборник целиком
Интерес к хитинолитическим ферментам связан, прежде всего, с возможностью использования продуктов гидролиза хитина в фармации и медицине. Известно, что хитоолигосахари-ды со степенью полимеризации 6-7 обладают противораковой и бактериостатической активностью (1). №ацетил^-глюкозамин и глюкозамин используются для лечения остеоартритов (2). Хитинолитические ферменты также перспективны в решении практических и теоретических задач биотехнологии. В частности, хитиназы могут применяться для ферментативного протопластирования клеток дрожжей и мицелиальных грибов при биохимических, генетических и молекулярно-биологических исследованиях эукариотических организмов. Кроме того, хитиназы представляют интерес при создании противогрибковых препаратов местного действия.
Хитинолитические ферменты широко распространены среди различных групп микроорганизмов. В результате ранее проведенного скрининга среди представителей рода Streptomyces был отобран штамм Streptomyces griseus var. streptomycini, активный по отношению к коллоидной и кристаллической формам хитина. Нативный хитин, обладающий жесткой кристаллической структурой, является трудноутилизируемым субстратом. Кроме того, вопросы его обработки связаны с определенными технологическими трудностями. В данной работе представляло интерес оценить влияние степени обработки хитина на уровень активности хитино-литических ферментов при периодическом культивировании.
Экспериментальная часть
Культивирование штамма Streptomyces griseus var. streptomycini проводили на среде Чапека, где вместо сахарозы использовались различные виды хитина панциря ракообразных, а именно: очищенный хитин в кристаллической и коллоидной формах, а также фракции неочищенного хитина с размером частиц менее 0,1мм; 0,1-0,2мм; 0,2-0,4мм.
Процесс очищения хитина включал в себя деминерализацию, депротеинизацию и обезжиривание согласно стандартным методикам.
Коллоидный хитин получали из очищенного и неочищенного хитина согласно стандартной методике с применением концентрированной соляной кислоты.
Уровень активность в нативном растворе оценивали по количеству восстанавливающих сахаров, образующихся при ферментативном гидролизе коллоидного хитина, по реакции с динитросалициловой кислотой.
Результаты и обсуждение
Оценку влияния степени обработки субстрата проводили по следующим параметрам: форма хитина (кристаллическая и аморфная); степень очистки (неочищенный и очищенный хитин), а также степень измельчения. Полученные результаты представлены на гистограмме.
1 - кристаллический неочищенный хитин, размер частиц 0,1-0,2мм;
2 - коллоидный очищенный хитин, размер частиц 0,1-0,2мм;
3 - кристаллический очищенный хитин, размер частиц 0,1-0,2мм;
4 - кристаллический неочищенный хитин, размер частиц менее 0,1 мм;
5 - кристаллический неочищенный хитин, размер частиц 0,2-0,4мм.
В качестве сравнения использовался кристаллический неочищенный хитин с размером частиц 0,1-0,2мм, хитиназная активность на котором принята за 100%. Было установлено, что при использовании в качестве субстрата очищенного хитина биосинтетическая активность практически не изменяется по сравнению с неочищенным. Присутствующие в панцире ракообразных примеси, по-видимому, оказывают влияние лишь на характеристики роста и развития продуцента и не влияют на индукцию синтеза хитиназ.
Степень измельчения субстрата также не оказала значительного влияния на уровень хити-назной активности. Минимальное содержание редуцирующих сахаров в культуральной жидкости в случае использования крупномолотой фракции хитина свидетельствует о том, что непосредственно хитин практически не утилизируется продуцентом, но эффективно индуцирует биосинтез хитинолитических ферментов.
При использовании в качестве субстрата коллоидной формы хитина наблюдалось увеличение уровня активности на 33%, что связано с существенным облегчением доступа фермента к гликозидным связям полимера. По мере накопления в среде секретируемый фермент активно гидролизует коллоидный хитин, образующиеся хитоолигомеры усиливают индуци-бельный эффект субстрата, что приводит к увеличению уровня активности хитинолититческих ферментов.
Заключение:
Таким образом, уровень активности хитинолитических ферментов практически не зависит от степени чистоты и измельчения субстрата, переведение его в коллоидную форму несколько усиливает биосинтетическую активность продуцента, однако для эффективной индукции синтеза хитиназ достаточно измельчения хитина до размера частиц 0,2-0,4 мм.
|
