|
Красноярский государственный ниверситет Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника
Удобным объектом для изучения старения на клеточном и молекулярном уровнях являются эритроциты млекопитающих – клетки, лишенные ядра и клеточных органоидов и не способные к биосинтезу белка. Старение эритроцитов – это физиологический процесс, в ходе которого происходит постепенное снижение интенсивности гликолиза, изменение ионного гомеостаза, нарушение структуры и функциональных свойств мембраны [1, 2, 3]
По вопросу о причинах, участвующих в процессах клеточного старения существуют различные взгляды. Одним из таких возможных механизмов является возрастзависимое усиление свободнорадикального окисления (СРО) [4, 5]. В подобных условиях существенно возрастает возможность окислительных модификаций свободными радикалами клеточных компонентов – белков, липидов, нуклеиновых кислот. Известно, что процессы СРО ограничиваются низкомолекулярными и ферментативными звеньями антиоксидантной системы (АОС). Одним из ключевых компонентов ферментативной АОС эритроцита является глутатион-S-трансфераза (ГSТ).
Физиологическая роль ГSТ эритроцитов изучена недостаточно. Предполагают, что локализация фермента в эритроцитах идеальна для удаления циркулирующих ксенобиотиков. При этом глутатион-S-трансферазы защищают эритроцитарные внутриклеточные компоненты от нежелательного взаимодействия с токсическими электрофильными и гидрофобными соединениями [6]. Наряду с вышесказанным, существует вероятность участия фермента в процессе биосинтеза гемоглобина, а также в хранении оксида азота в клетке [7].
Несмотря на то, что в последние годы большое внимание уделяется изучению свойств глутатион-S-трансферазы работ по изучению активности ГSТ в красных клетках крови, образованных в условиях напряженного эритропоэза, мы не встретили.
В связи с этим, задачей настоящей работы явилось изучение активности глутатион-S-трансферазы при старении эритроцитов, продуцированных после массивной кровопотери.
Материалы и методы
Объектом исследования служили кролики породы „Шиншилла” весом 2,5 –3,0 кг. Забор крови осуществляли капельным методом из краевой вены уха кролика. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. Напряженный эритропоэз достигался одноразовым кровопусканием 43 % всей массы крови животного. Исследования проводились во фракциях молодых (ФМЭ), старых эритроцитов (ФСЭ) и общей эритроцитарной массе (ОЭМ) у интактных кроликов, а затем у одной группы животных на 7 и у второй – на 20 день после кровопотери. Для разделения эритроцитов на возрастные группы кровь подвергалась многократному центрифугированию с последовательным отбором верхней и нижней частей эритроцитарного столба [8]. Качество фракционирования проверялось подсчетом ретикулоцитов.
Активность ГSТ определяли по скорости образования глутатион-S-коньюгатов. Увеличение концентрации коньюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм [9].
Полученные данные обрабатывались статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
Таблица Активность ГSТ в эритроцитах разного возраста у интактных кроликов, на 7 и на 20 сутки после кровопотери (n=10) | Фракции клеток | Сроки исследования | Активность ммоль /мин ´ гHb | Р | | ФМЭ | Фон 7 сутки 20 сутки | 3,98 ± 0,09 5,70 ± 0,21 4,70 ± 0,08 | < 0,001 < 0,001 < 0,001 | | ОЭМ | Фон 7 сутки 20 сутки | 2,63 ±0,06 3,78 ± 0,11 3,60 ± 0,06 | < 0,001 < 0,001 < 0,001 | | ФСЭ | Фон 7 сутки 20 сутки | 2,05 ± 0,06 2,95 ± 0,11 2,35 ± 0,08 | < 0,001 < 0,001 < 0,001 |
Исследование общей эритроцитарной массы и фракции старых эритроцитов на 7 и 20 сутки после кровопотери показало, что изменение активности ГSТ имеет ту же направленность, что и во фракции молодых эритроцитов в те же моменты времени.
Поскольку средний календарный возраст ФСЭ на 20 сутки после кровопотери близок к среднему календарному возрасту ОЭМ у интактных кроликов (в этот период после кровопотери в кровяном русле циркулируют клетки не старше 20 дней, тогда как возраст старых эритроцитов у интактных животных – 50-60 дней) [10], можно сопоставить значения активности фермента в этих фракциях. При рассмотрении полученных результатов можно сделать вывод о том, что эритроциты, продуцированные в ответ на стресс-воздействие (массивную кровопотерю), первоначально характеризуются повышенной активностью глутатион-S-трансферазы. Однако, при старении этих клеток происходит более быстрое чем в норме снижение активности фермента (активность ГSТ на 20 день после кровопотери меньше на 11%, чем активность ГSТ в ОЭМ у фоновых животных, принятой за 100%).
На наш взгляд существует несколько причин изменения активности фермента при старении эритроцитов в условиях напряженного эритропоэза. Согласно литературным данным одним из таких факторов может служить изменение изоферментного спектра глутатион-S-трансферазы [11]. Во-вторых, причиной увеличения активности фермента может быть либо изменение количества фермента в клетке, либо изменение его кинетических свойств. Последнее подтверждают данные по изучению кинетики фосфофруктокиназы и лактатдегидрогеназы при старении эритроцитов, образованных в условиях напряженного эритропоэза [1, 2]. В пользу увеличения количества фермента в ходе его синтеза говорит зависимость экспрессии гена ГSТ от продукции активных форм кислорода (АФК) [6, 12], образование которых увеличивается в результате активации свободнорадикальных реакций по всей системе эритрон на фоне развития гипоксического шока при кровопотере [13].
Усиление СРО может приводить не только к стимуляции экспрессии ГSТ и, следовательно, к увеличению количества фермента, но также и к более выраженному повреждению уже синтезированных молекул фермента активными формами кислорода. Модификация ферментов АФК может приводить к окислению SH-групп, дезаминированию и ряду других изменений [5, 14]. Поскольку эритроцит является безъядерной клеткой, неспособной к биосинтезу белка, то с возрастом количество модифицированных, функционально неактивных белков возрастает [15], что может служить аргументом в пользу более быстрого, чем в норме снижения активности глутатион-S-трансферазы по мере старения эритроцита. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Титова Н.М. Лактатдегидрогеназа при старении эритроцитов: Автореф.дис. …канд. биол. наук.-Ленинград, 1984.-24 с.
2. Смолина Е.В., Авраамова Т.В. Влияние эффекторов на активность фофсфофруктокиназы при старении эритроцтов/Коррекция гомеостаза.-Красноярск, 1996.-С.111-112.
3. Боровкова Г.И. Фосфолипиды и холестерин при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза: Автореф.дис. …канд. биол. наук.-Ленинград, 1983.-23 с.
4. Harman D. Free radical theory of aging// Mutation res. - 1992. - V.275. - P.257.
5. Beckman K.B., Ames B.N. The free radical theory of aging maturos// Physiological Revies. – 1998. - V.78. – P.547-581.
6. Rashmore T.H., Pickett C.B. Glutathione S-transferases, structure, regulation, and therapeutic implications// J. Biol. Chem. - 1993. - V.268. – P.11475-11478.
7. Bello M., Nuccetelli M., Caccuri A.M., Stella L. et al. Human glutathione S-trasferase P1-1 and nitric oxide carriers// J. Biol. Chem. – 2001. – V.276. – P.42138-42145.
8. Авраамова Т.Н., Титова Н.М. Руководство по большому биохимическому практикуму. Углеводный обмен. – Красноярск,1978. – 107С.
9. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymes step mercapturic acid formation// J.Biol.Chem. - 1974. - V.249. - P.7130-7139.
10. Поэтова В.Т., Гительзон И.И., Терсков И.А. Изменения в качественном составе эритроцитов, продуцированных при напряженном эритропоэзе. – В кн.: Вопросы биофизики, биохимии и патологии эритроцитов. Вып.2. – М.: Наука,1967. – с.27-31.
11. Fazi A., Accorsi A., Piatti E., Magnani M. Cell age dependent decay of human erythrocytes glutathione S-transferase// Mech. Ageing Dev. – 1991. - V.58. – P.255-266.
12. Galli F., Rovadati S., Benedetti S., Buoncristiani U. et al. Overexpression of erythrocyte glutathione S-transferase in uremia and dialysis// Clin. Chem. – 1999.- V.45. – P.1781-1788.
13. Бурлакова Е.Б., Губарева А.Е., Архипова Г.В., Розинский В.А. Модуляция перекисного окисления липидов биогенными аминами в модельных системах// Вопросы мед. химии. – 1992. - №2. – С.17-21.
14. Berlett B.S., Stadtman E.R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress// J. Biol. Chem. – 1997. – V.272. – P.20313-20316.
15. Кудряшов А.М. Исследование роли глутатионовой системы в естественном старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза: Автореф.дис. …канд. биол. наук.-Тюмень, 2002.-21 с.
|
