Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра,  Казанский государственный медицинский университет

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Введение
    Нейромедиаторная функция ацетилхолина (АХ) опосредуется двумя типами рецепторов: ионотропными никотиновыми (нХР) и метаботропными мускариновыми (мХР) холинорецепторами. нХР представляет собой пентамерный мембранный белок, формирующий неселективный ионный канал. мХР – это мономерный белок, имеющий 7 трансмембранных участков и сопряженный с G-белком. Установлено, что у позвоночных, и в частности, у млекопитающих, экспрессируется 5 подтипов мХР (М1-М5). Рецепторы М1, М3, М5 сопряжены с G-белками семейства Gq/11, тогда как холинорецепторы М2 и М4 связаны с пертуссис токсин-чувствительными белками семейства Gi/Go. При активации рецепторов М1, М3, М5, как правило, происходит опосредованное фосфолипазой C образование инозитолтрифосфата и диацилглицерола, тогда как активация мХР М2 и М4 сопровождается ингибированием аденилатциклазы [1,2].
Как нХР, так и мХР обнаружены в различных отделах центральной и периферической нервной системы. При этом общеизвестно, что нХР играют ключевую роль в передаче нервного возбуждения с нерва на скелетную мышцу, тогда как мХР опосредуют сокращение гладкой мышцы и участвуют в регуляции работы сердечной мышцы [1,2,3]. Несмотря на то, что контакт между двигательным нервным окончанием и скелетным мышечным волокном является на сегодняшний день наиболее изученным синаптическим аппаратом, а нХР концевой пластинки, в свою очередь, наиболее исследованным нейромедиаторным рецептором, тем не менее, вопрос о наличии и роли мХР в нервно-мышечном синапсе все еще остается открытым. Анализ данных, касающихся этого вопроса, явился целью настоящего обзора.
    Большинство данных,  тем или иным образом имеющих отношение к предмету нашего обзора, получены на нервно-мышечных препаратах портняжной мышцы лягушки и диафрагмы мыши или крысы с использованием мускариновых агонистов и антагонистов различной степени специфичности. В связи с этим, стоит напомнить, что классическими мускариновыми агонистами (помимо АХ) являются мускарин и оксотреморин, а блокаторами – атропин и скополамин.
Нервно-мышечный синапс земноводных
При изучении синаптических ответов в нервно-мышечном соединении лягушки (регистрация токов концевой пластинки (ТКП)) было показано, что атропин и скополамин дозо-зависимо снижают амплитуду и уменьшают длительность ТКП [4,5,6]. Естественно было предположить, что блокатор, в данном случае атропин, действуя на постсинаптическую мембрану, может взаимодействовать с нХР саркоплазмы, и, тем самым, изменять амплитудно-временные параметры ТКП. Однако, более подробный анализ действия атропина на ТКП это предположение не подтвердил [5].
    Дальнейшие исследования позволили получить данные, свидетельствующие в пользу пресинаптического действия мускариновых агентов. Карбахолин и метахолин, способные активировать как нХР, так и мХР, а также мускарин и оксотреморин снижали частоту спонтанной квантовой секреции АХ [7,8,9]. В случае же с вызванной квантовой секрецией наблюдалось уменьшение квантового состава ответа, которое устранялось добавлением атропина [7,8]. При этом сам атропин не влиял ни на частоту спонтанной, ни на квантовый состав вызванной секреции. Более того, были обнаружены два достаточно интересных факта: 1) увеличение концентрации оксотреморина приводит к снижению амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки, которое не устраняется атропином [8], что в дальнейшем приведет к дискуссии о специфичности действия оксотреморина (его возможном никотиновом действии) и станет одним из аргументов противников «мускариновой теории»; 2) эффект мускарина на частоту отсутствовал, если спонтанная квантовая секреция была изначально снижена под действием блокаторов холинэстеразы; при этом собственный угнетающий эффект ингибитора холинэстеразы устранялся атропином [9]. Этот факт впервые позволил сделать предположение о функциональном взаимодействии мускарин-чувствительных структур и синаптической ацетилхолинэстеразы, что впоследствии получит неоднократное подтверждение [10,11,12,13].
    Тот факт, что у таких классических мускариновых агентов как атропин, оксотреморин и оксотреморин М была обнаружена способность связываться с нХР [8,14,15,16], а также отсутствие при этом альтернативных методик выявления мускариновых рецепторов, поставили под сомнение наличие мХР в нервно-мышечном синапсе земноводных. Однако значительный прогресс в изучении структуры, свойств и функций мХР, наряду с появлением новых методологических подходов, позволил пересмотреть уже имеющиеся данные и получить очередные доказательства участия этих структур в функционировании нервно-мышечного аппарата. Так, в серии работ Slutsky et al. [17,18,19] было показано, что мускарин способен как угнетать, так и облегчать секрецию АХ. При этом, угнетающий эффект опосредуется активацией М2-ХР и не зависит от внеклеточного кальция, тогда как облегчающее влияние имеет кальциевую зависимость и опосредуется М1-ХР.
    Несомненного внимания заслуживает факт обнаружения мХР на мембране перисинаптических Шванновских клеток [20,21], которые в последнее время изучаются весьма интенсивно, особенно в аспекте нервно-мышечной передачи.
    Подводя небольшой итог, можно заключить, что большинство имеющихся на сегодняшний день экспериментальных данных свидетельствует в пользу наличия в нервно-мышечном соединении земноводных мХР, физиологическое значение которых, по-видимому, состоит в модуляции процессов секреции АХ на пресинаптическом уровне. В то же время вопросы точной локализации этих рецепторных структур и возможности постсинаптического действия мускариновых агентов все еще остаются открытыми.
Нервно-мышечный синапс млекопитающих
В многочисленных работ на нервно-мышечном синапсе млекопитающих были получены неоднозначные и противоречивые данные о влиянии таких классических мускариновых агентов, как оксотреморин и атропин. На нервно-мышечном препарате диафрагмы мыши и крысы продемонстрировано, что оксотреморин способен как увеличивать [22,23], так и угнетать [24,25] спонтанную и вызванную секрецию АХ. В то же время получены результаты, свидетельствующие об отсутствии влияния оксотреморина на выделение медиатора [26,27]. Что же касается атропина, то за исключением работы S.J. Hong and C.C. Chang [23], где показано отсутствие влияния этого м-холиноблокатора как на синаптическую передачу, так и собственно на сокращение мышцы, атропин, согласно многочисленным данным других авторов, вызывал облегчение нервно-мышечной передачи, проявляющееся как в увеличении секреции АХ, так и в усилении сокращений диафрагмальной мышцы [10,24,25,26,28,29,30].
Анализ этих данных позволяет сделать, как минимум, три возможных предположения, способных объяснить противоречивость полученных результатов:
1). Мускариновые рецепторы нервно-мышечного синапса млекопитающих имеют определенные фармакологические особенности, отличающие их от мХР ЦНС, ганглиев, сердечной и гладкой мускулатуры;
2). Оксотреморин и атропин проявляют свойства «никотинового характера», что не позволяет интерпретировать полученные эффекты активацией или блокадой мХР и вообще ставит под сомнение само наличие этих рецепторов в концевой пластинке;
3). Возможно, что имеет место наличие нескольких популяций мХР, различающихся не только в механизмах трансдукции сигнала, но и в их локализации в пределах нервно-мышечного соединения.
    Интересно отметить, что каждое из этих предположений небезосновательно и имеет в своем арсенале определенные экспериментальные доказательства. Так, в отношении первого предположения. Аффинность мускариновых агонистов к пресинаптическим рецепторам синаптосом электрического органа Torpedo оказалось значительно выше их аффинности ко многим известным постсинаптическим рецепторам [31]. Далее, на препарате мышцы m. levator auris longus крысы показано участие М2-ХР в механизме угнетения вызванной секреции АХ, тогда как эффект активации этих рецепторов в раннем постнатальном периоде полностью противоположный [32]. И, наконец, обнаруженные на мембране Шванновских клеток мХР полностью инактивировались галламином (м-антагонистом) и не блокировались такими мускариновыми антагонистами как N-метил-скополамин, QNB и атропин. Последний лишь частично мог снимать эффект агонистов мХР, но в очень высокой концентрации [21]. Позднее, наличие мХР на мембране Шванновских клеток было подтверждено имммуногистохимически [33].
Относительно второго предположения. Экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу «никотиновых свойств» оксотреморина и атропина [8,14,15,16], в настоящее время можно интерпретировать несколько иначе, чем это было сделано авторами, что не позволяет воспринимать полученные результаты как веский аргумент против наличия мХР в нервно-мышечном синапсе. Коснемся лишь работ, сделанных на культурах мышечных элементов [14,15,16], результаты которых уже сами по себе нельзя без оговорки экстраполировать на дифференцированные зрелые мышечные волокна. Кроме этого необходимо заметить, что выбор культуры мышечных элементов изначально предполагал отсутствие на мембране мХР и наличие классических нХР. Однако, именно на культуре скелетной мышцы достаточно четко фармакологически было показано наличие мХР (предположительно М1-подтипа), активация которых приводит к увеличению инозитолтрифосфата в цитоплазме; более того, к подобному эффекту приводит также активация нХР, что сопровождается не только увеличением цитозольного кальция, освобождаемого из внутриклеточных депо, но и усилением активности протеинкиназы C, которая, по-видимому, вовлечена в регуляцию функциональных свойств нХР [34,35,36]. Таким образом, результаты, полученные на материале культуры мышечных элементов, похоже, нельзя интерпретировать однозначно.
В том же ключе, а именно в рамках современного анализа ранее полученных данных, можно взглянуть и на такой, казалось бы, веский аргумент против локализации мХР в нервно-мышечном синапсе, как отсутствие специфического связывания мускаринового лиганда [3H]-QNB в гомогенате диафрагмы [37]. Данный факт на сегодняшний день нельзя рассматривать как подтверждение отсутствия мХР в нервно-мышечном синапсе, поскольку уже очевидно, в частности, на примере мХР Шванновских клеток [21,33], что может иметь место определенная фармакологическая особенность мХР, выражающаяся в низком сродстве к данному лиганду возможно в купе с недостаточно высокой плотностью популяции рецепторов.
Возвращаясь к третьему предположению, способному объяснить столь неоднозначные эффекты атропина и оксотреморина наличием нескольких популяций мХР, различающихся не только в реализации механизмов трансдукции сигнала, но и в их локализации в пределах нервно-мышечного соединения. Пожалуй, это предположение можно рассматривать как наиболее подкрепленное экспериментальными данными. Так, в частности, на одном и том же препарате, было показано, что оксотреморин в низкой концентрации (10 нмоль/л) способен увеличивать, а в высокой (1 мкмоль/л) - уменьшать вызванную секрецию АХ, причем оба эти эффекта устранялись скополамином [11,38]. Как оказалось, действие атропина также может изменяться на противоположное в зависимости от концентрации: в диапазоне от 1 нмоль/л до 1 мкмоль/л преобладал облегчающий, а в концентрации более 1 мкмоль/л – угнетающий мышечные сокращения эффект [39]. По-видимому, имеющиеся до недавнего времени столь разноречивые сведения относительно действия классических мускариновых лигандов есть результат различий мХР как в локализации, так и в механизмах передачи сигнала; эти различия и проявляются при изменении концентрации фармакологических агентов.
Пролить свет на все эти предположения, призванные объяснить противоречивость полученных результатов, помогли новые методы исследования, а также синтез целого спектра высокоизбирательных соединений, которые имеют относительно высокую специфичность к уже идентифицированным подтипам рецепторов.
    Констатируя современные данные, особенно стоит отметить работу Minic et al. [13], где авторам удалось методами хемилюминисценции и «Western blot» анализа продемонстрировать наличие мХР в нервно-мышечном синапсе мыши. Однако, на вопрос о более конкретной локализации, ответить довольно трудно. Хотя пресинаптический эффект активации мХР позволяет предполагать локализацию этих рецепторов на мембране нервной терминали, тем не менее имеется достаточно данных, свидетельствующие в пользу того, что мХР могут локализоваться и на мембране перисинаптических Шванновских клеток [33,40] и на мембране скелетного мышечного волокна, где данные рецепторы могут участвовать в процессах, обеспечивающих синаптическую пластичность и нейротрофический контроль свойств мышечного волокна [34,36,41,42,43,44]. В отношении же влияния мХР на секрецию АХ из двигательного нервного окончания, к настоящему моменту выявлено, что активация М1-ХР приводит к облегчению, а активация М2-ХР – к угнетению секреции АХ [32,45,46], подобно тому как это имеет место в нервно-мышечном синапсе лягушки.   
    Таким образом, в настоящее время есть все основания полагать, что в нервно-мышечном синапсе млекопитающего имеются мХР, которые, по-видимому, как и в концевой пластинке земноводных, могут участвовать в регуляции секреции АХ из двигательных нервных окончаний. Большинство работ свидетельствует в пользу того, что эти рецепторы относятся к М1 и М2-подтипу, которые предположительно могут локализоваться не только на мембране нервной терминали, но и на поверхности перисинаптических Шванновских клеток и на мембране скелетного мышечного волокна, где данные рецепторы могут участвовать в процессах, обеспечивающих синаптическую пластичность и нейротрофический контроль свойств мышечного волокна.
Заключение
    Изучение возможности участия мХР в функционировании нервно-мышечного соединения позвоночных до недавнего времени было сопряжено с рядом трудностей, к числу которых можно отнести: а) небольшой набор фармакологических агентов, специфичность которых была поставлена под сомнение; б) отсутствие методик, позволяющих четко отделять пресинаптический эффект от постсинаптического, и эффект активации мХР от эффекта активации нХР; в) отсутствие возможности разделения, порой противоположных, эффектов активации разных популяций мХР. В настоящее время эти методологические проблемы более или менее устранены.
Подытоживая все вышеизложенное можно заключить, что имеющиеся на сегодняшний день экспериментальные данные в подавляющем большинстве своем свидетельствуют в пользу наличия мХР в нервно-мышечном синапсе позвоночных, где, по-видимому, одна из их основных функций заключается в регуляции секреции АХ из двигательных нервных окончаний. Тем не менее, окончательную точку в данном вопросе можно будет поставить только тогда, когда будут однозначно идентифицированы и выделены функциональные мХР из нервно-мышечного аппарата.
Работа поддержана грантами РФФИ (№ 02-04-48903, 00-15-97763), грантом Фонда НИОКР РТ (№ 03-3.8-173) и грантом Президента РФ «Ведущая научная школа» (НШ-1063.2003.4)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.    Hosey M. (1992) FASEB J. 6, 845-852.
2.    Caulfield M., Birdsall N. (1998) Pharmacol. Rev. 50, 279-290.
3.    Eglen R.M., Hegde S.S., Watson N. (1996) Pharmacol. Rev. 48, 531-565.
4.    Adler M., Albuquerque E.X. (1976) J. Pharmacol. Exp. Ther. 196, 360-372.
5.    Feltz A., Large W.A., Trautmann A. (1977) J. Physiol. 269, 109-130.
6.    Feltz A., Large W.A. (1976) Br. J. Pharmacol. 56, 111-113.
7.    Arenson M.S. (1991) Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 343, 128-133.
8.    Arenson M.S. (1989) Neuroscience 30, 827-836.
9.    Duncan C.J, Publicover S.J. (1979) J. Physiol. 294, 91-103.
10.    Vizi E.S., Somogyi G.T. (1989) Br. J. Pharmacol. 97, 65-70.
11.    Wessler I., Karl M., Mai M., Diener A. (1987) Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 335, 605-612.
12.    Minic J., Chatonnet A., Krejci E., Molgo J. (2003) Br. J. Pharmacol. 138, 177-187.
13.    Minic J., Molgo J., Karlsson E., Krejci E. (2002) Eur. J. Neurosci. 15, 439-448.
14.    Entwistle A., Zalin R.J., Warner A.E., Bevan S. (1988) J. Cell Biol. 106, 1703-1712.
15.    Reitstetter R., He D.S., Gruener R. (1994) Eur. J. Pharmacol. 264, 27-32.
16.    Haggblad J., Eriksson H., Heilbronn E. (1985) Acta Pharmacol. Toxicol. (Copenh.) 57, 317-321.
17.    Slutsky I., Parnas H., Parnas I. (1999) J. Physiol. 514, 769-782.
18.    Slutsky I., Silman I., Parnas I., Parnas H. (2001) J. Physiol. 536, 717-725.
19.    Slutsky I., Rashkovan G., Parnas H., Parnas I. (2002) J. Neurosci. 22, 3426-3433.
20.    Jahromi B.S., Robitaille R., Charlton M.P. (1992) Neuron 8, 1069-1077.
21.    Robitaille R., Jahromi B.S., Charlton M.P. (1997) J. Physiol. 504, 337-347.
22.    Das M., Ganguly D.K., Vedasiromoni J.R. (1978) Br. J. Pharmacol. 62, 195-198.
23.    Hong S.J, Chang C.C. (1990) Brain Res. 534, 142-148.
24.    Prado W.A., Corrado A.P. (1987) Gen. Pharmacol. 18, 75-81.
25.    Somogyi G.T., Vizi E.S., Chaudhry I.A., Nagashima H., Duncalf D., Foldes F.F., Goldiner P.L. (1987) Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336, 11-15.
26.    Abbs E.T., Joseph D.N. (1981) Br. J. Pharmacol. 73, 481-483.
27.    Gundersen C.B., Jenden D.J. (1980) Br. J. Pharmacol. 70, 8-10.
28.    Alves-do-Prado W., Corrado A.P., Prado W.A. (1992) Gen. Pharmacol. 23, 125-129.
29.    Alves-do-Prado W., Prado W.A. (1993) Gen. Pharmacol. 24, 1501-1504.
30.    Wali F.A., Suer A.H., McAteer E., Dark C.H., Jones C.J. (1988) Gen. Pharmacol. 19, 285-290.
31.    Kloog Y., Michaelson D.M., Sokolovsky M. (1980) Brain Res. 194, 97-115.
32.    Santafe M.M., Salon I., Garcia N., Lanuza M.A., Uchitel O.D., Tomas J. (2003) Eur. J. Neurosci. 17, 119-127.
33.    Georgiou J., Robitaille R., Charlton M.P. (1999) J. Neurosci. 19, 3836-3846.
34.    Eusebi F., Grassi F., Nervi C., Caporale C., Adamo S., Zani B.M., Molinaro M. (1987) Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 230, 355-365.
35.    Grassi F., Giovannelli A., Fucile S., Eusebi F. (1993) Pflugers Arch. 422, 591-598.
36.    Reyes R., Jaimovich E. (1996) Arch. Biochem. Biophysics. 331, 41-47.
37.    Haggblad J., Heilbronn E. (1983) Br. J. Pharmacol. 80, 471-476.
38.    Wessler I., Diener A., Offermann M. (1988) Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 338, 138-142.
39.    Wali F.A., Suer A.H., McAteer E.J., Dark C.H. (1987) Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 288, 120-135.
40.    Rochon D., Rousse I., Robitaille R. (2001) J. Neurosci. 21, 3819-3829.
41.    Liu T.P., Yu P.-C., Liu I-M., Tzeng T.-F., Cheng J.-T. (2002) Autonomic Neurosci.: Basic and Clinical. 96, 113-118.
42.    Urazaev A., Naumenko N., Malomough A., Nikolsky E., Vyskocil F. (2000) Neurosci. Res. 37, 255-263.
43.    Науменко Н.В., Маломуж А.И., Хаирова Р.А., Зефиров А.Л., Уразаев А.Х. (2002) Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова 88, 619-626.
44.    Хаирова Р.А., Маломуж А.И., Науменко Н.В., Уразаев А.Х. (2003) Бюлл. экспер. биол. и мед. 135, 140-142.
45.    Oliveira L., Timoteo M.A., Correia-de-Sa P. (2002) Eur. J. Neurosci. 11, 1728-1736.
46.    Slutsky I., Wess J., Gomeza J., Dudel J., Parnas I., Parnas H. (2003) J. Neurophysiol. 89, 1954-1967