Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Введение
Общепризнанно, что в синапсах ЦНС глутамат, выступая в качестве основного возбуждающего нейромедиатора, участвует в механизмах установления, развития, функционирования, регуляции и элиминации синаптических контактов [1,2,3,4]. Более того, глутамат является возбуждающим нейромедиатором и в нервно-мышечных соединениях большинства беспозвоночных животных [5], тогда как у позвоночных эту функцию выполняет ацетилхолин [6]. Тем не менее, исследования последних лет позволяют предполагать, что глутаматэргическая медиация может иметь место и в нервно-мышечном соединении позвоночных животных, в том числе и у млекопитающих. Одним из основных аргументов в пользу данного предположения является обнаружение рецепторов к глутамату в зоне концевой пластинки позвоночных. Рассмотрению этих фактов и посвящена настоящая работа. Однако, прежде чем перейти непосредственно к обзору, стоит несколько слов сказать о собственно самих глутаматных рецепторах.
Классификация глутаматных рецепторов
Нейромедиаторная функция глутамата опосредуется специфическими мембранными надмолекулярными структурами – глутаматными рецепторами, среди которых выделяют два класса: ионотропные и метаботропные рецепторы. Ионотропные рецепторы (iGluR) содержат в своем составе катион-специфические ионные каналы и делятся на три подкласса: α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионатные (AMPA), каинатные и N-метил-D-аспартатные (NMDA) рецепторы. Метаботропные рецепторы (mGluR) связаны с G-белками и, основываясь на аминокислотной последовательности, фармакологических свойствах и механизмах трансдукции сигнала, в свою очередь, подразделяются на три группы: mGluR I (включает в себя рецепторы mGluR1, mGluR5), mGluR II (mGluR2, mGluR3) и mGluR III (mGluR4, mGluR5, mGluR6). Детальное описание структуры, свойств и физиологических функций глутаматных рецепторов представлено в обзорах [4,7,8,9].
Источник глутамата в нервно-мышечном синапсе позвоночных
Большинство данных, полученных к настоящему моменту, свидетельствует в пользу того, что глутамат может выделяться в синаптическую щель из двигательных нервных окончаний наряду с ацетилхолином. Так, на препарате «спинной мозг – седалищный нерв – икроножная мышца» лягушки был продемонстрирован захват меченного глутамата нейронами спинного мозга, транспорт аминокислоты по нерву и выделение ее из нервного окончания. Более того, был показан и обратный процесс, а именно, захват молекул глутамата из раствора, в котором инкубировалась мышца, и центростремительный транспорт аминокислоты в спинной мозг. При этом было доказано, что аминокислота транспортируется именно по аксонам двигательных нейронов [10]. Развитие иммуногистохимии в конце 90-х позволило выявить достаточно высокую концентрацию эндогенного глутамата как в отростках мотонейронов Xenopus, развивающихся в культуре [11], так и в двигательных нервных окончаниях зрелых концевых пластинок крысы [12]. Более детальное изучение распределения аминокислоты в зоне нервно-мышечного синапса крысы было проведено O. Waerhaug и O.P. Ottersen [13] с использованием электрономикроскопической иммуноцитохимии. Авторами было показано, что глутамат присутствует во всех компартменах нервно-мышечного аппарата со значительным преобладанием именно в нервных терминалях. Концентрация глутамата в двигательном нервном окончании длинного разгибателя пальцев была оценена в пределах 10-20 ммоль/л. Необходимо отметить, что в этой же работе удалось продемонстрировать непосредственную ассоциацию молекул глутамата с синаптическими везикулами в нервной терминали, что, в свою очередь, предполагает возможность совместной секреции ацетилхолина и глутамата в синаптическую щель.
В пользу возможного выделения глутамата (как ко-медиатора ацетилхолина) из двигательных нервных окончаний свидетельствуют результаты, полученные на синаптосомах нервных терминалей электрического органа Torpedo [14], которые до недавнего времени считались «чисто холинэргической системой». Оказалось, что  помимо ацетилхолина в синаптосомах в значительном количестве присутствует глутамат, который способен выделяться кальций-зависимым образом вместе с ацетилхолином. Факт совместного выделения глутамата и ацетилхолина из синаптосом холинэргических нервных терминалей электрического органа Torpedo кальций-зависимым образом был подтвержден и позднее [15].
Вышеприведенные работы свидетельствуют о наличии глутамата в двигательных нервных терминалях позвоночных и о возможности его секреции в синаптическую щель вместе с ацетилхолином. Однако нельзя полностью отрицать возможность выделения глутамата и из других компартменов концевой пластинки. Так, есть данные, что из мышечных волокон в окружающую среду могут диффундировать креатин и некоторые аминокислоты, в том числе глутамат [16]. С другой стороны, относительно высокое содержание глутамата обнаружено в Шванновских клетках, окружающих нервно-мышечный синапс крысы [13]. Помимо этого, следует учесть и возможность поступления глутамата в синаптическую щель из внеклеточной среды, где имеет место относительно высокое содержание аминокислоты. Так концентрация глутамата в плазме млекопитающих оценена в 50-60 мкмоль/л, в спинномозговой жидкости около 10 мкмоль/л, тогда как непосредственно в экстраклеточной жидкости это значение составляет 3-14 мкмоль/л [17,18].
Тем не менее, большинство работ свидетельствуют в пользу того, что глутамат, выделяемый в синаптическую щель нервно-мышечного соединения позвоночных, имеет, скорее всего, нейрональное происхождение.
Глутаматные рецепторы в нервно-мышечном синапсе земноводных
    На культурах однодневных спинальных нейронов и миоцитов эмбрионов Xenopus после установления синаптического контакта было продемонстрировано, что добавление глутамата весьма значительно увеличивает частоту спонтанных синаптических токов, причем более детальное фармакологическое исследование показало вовлечение в этот эффект широкого спектра ионотропных глутаматных рецепторов, а именно каинатных, AMPA и NMDA рецепторов [11,19,20]. Авторами не только зарегистрирован глутамат-, каинат- и NMDA-индуцированный входящий ток, но и выявлено, что основная популяция глутаматных рецепторов локализована именно на нервной терминали мотонейрона в области синаптического контакта [11,19,20,21]. В то же время, было получено и подтверждение ранее установленного факта наличия глутаматных рецепторов на самой соме мотонейрона [22,23]. Тем не менее, авторы полностью не исключают и постсинаптической локализации мишени для действия аминокислоты, поскольку с увеличением частоты увеличивалась и амплитуда постсинаптических токов, а это, при условии неизменности размера выделяемого кванта ацетилхолина, свидетельствует об изменении функциональных свойств именно постсинаптической мембраны мышечного волокна [19].  
    Электрофизиологические доказательства наличия глутаматных ионотропных рецепторов в концевой пластинке Xenopus были получены не только в культуре клеток, но и на препаратах нервно-мышечного синапса головастиков [24]. При этом необходимо отметить два следующих момента. Во-первых, если в культуре агонист глутаматных метаботропных рецепторов ACPD не оказывал никакого эффекта [19], то в данном случае тот же препарат угнетал секрецию ацетилхолина, в отличие от агонистов ионотропных рецепторов; при этом, ингибирующее влияние ACPD не развивалось в присутствии блокатора метаботропных рецепторов. Во-вторых, отмечено, что потенциирующий секрецию ацетилхолина эффект агонистов глутаматных ионотропных рецепторов значительно снижается у более взрослых головастиков [24].
Обнаружение глутаматных рецепторов в нервно-мышечном синапсе Xenopus и выявленные эффекты их активации, заключающиеся в регуляции процессов секреции ацетилхолина, позволяют предположить важную роль этих аминокислотных рецепторов в установлении и развитии нервно-мышечного контакта, по крайней мере, у земноводных. Вопрос о наличии и физиологическом значении глутаматных рецепторов в зрелом нервно-мышечном синапсе гомойотермных позвоночных все еще остается открытым.
Глутаматные рецепторы в нервно-мышечном синапсе млекопитающих
В отличие от нервно-мышечного синапса Xenopus, в концевой пластинке млекопитающих на сегодняшний день обнаружены лишь глутаматные ионотропные NMDA рецепторы, причем, начиная с самой первой публикации по этому вопросу, стали накапливаться доказательства постсинаптической локализации этих рецепторов. Так, в работе U. Berger et al. [25]  на нервно-мышечном препарате крысы было показано, что иммунореактивность к NR1 (фундаментальной, каналобразующей субъединице NMDA рецептора) тесно ассоциирована с αBTX-связывающими сайтами, что предполагает совместную локализацию ацетилхолиновых и NMDA рецепторов на постсинаптической мембране мышечного волокна. Проведение Western blot анализа белка, ответственного за NMDA-подобную иммунореактивность, подтвердило тот факт, что на мембране скелетного мышечного волокна присутствует NR1 субъединица NMDA рецептора [25].  Чуть позже была продемонстрирована и экспрессия NR2 субъединицы NMDA рецептора в скелетной мышце крысы [26].
    Результаты, подтверждающие постсинаптическую локализацию NMDA рецепторов в нервно-мышечном соединении мыши и крысы, были получены и в работе Z. Grozdanovic и R. Gossrau [27]. При этом было выявлено, что NMDA рецепторы локализованы исключительно в синаптической зоне и тесно ассоциированы с ферментом NO-синтаза преимущественно в мышечных волокнах II типа. Непосредственная ассоциация NO-синтазы с NMDA рецепторами, выявленная в нервной ткани, опосредуется белками семейства PSD [28, 29]. Механизм данного взаимодействия рецепторно-канального комплекса и фермента основывается на так называемых PDZ-PDZ связях [30]. Доказательства, свидетельствующие в пользу подобного взаимодействия NMDA рецептора и NO-синтазы, были получены на культуре скелетной мышечной ткани мыши с помощью иммуноцитохимии [31]. Так, была продемонстрирована непосредственная ко-агрегация NMDA рецепторов с NO-синтазой в постсинаптической области и показана отчетливая совместная локализация NMDA рецепторов с белком PSD-95 с одной стороны, и NO-синтазы c PSD-95, с другой. Известно, что PDZ-PDZ взаимодействия NMDA рецепторов и семейства синаптических белков PSD в большей степени опосредуются NR2 субъединицей, а не NR1 [28]. В тоже время есть основания полагать наличие другого механизма заякоривания NMDA рецепторов в мембране мышечного волокна, поскольку известно, что некоторые изоформы NR1 субъединицы, полученные в результате альтернативного сплайсинга, способны связываться с белком Yotiao, участвующим в организации цитоскелета постсинаптической мембраны, как у нейронов головного мозга, так и у скелетных мышечных волокон крысы [32].
    Данные, полученные в работах на теплокровных с применением электрофизиологических подходов, полностью согласуются с результатами иммуногистохимических и иммуноцитохимических исследований. Так, H. Koyuncuoğlu et al. [33] продемонстрировали, что блокаторы NMDA рецепторов подавляют вызванные непрямой стимуляцией сокращения диафрагмальной мышцы крысы, чего не наблюдалось, если проводилась прямая стимуляция мышцы. В ряде исследований, проведенных в нашей лаборатории, были получены данные, свидетельствующие не только в пользу того, что на мембране мышечного волокна крысы имеются функционально-активные NMDA рецепторы, но и факты, подтверждающие функциональную связь глутаматных рецепторно-канальных комплексов и фермента NO-синтазы. При этом показано, что глутамат и глутаматные рецепторы могут участвовать как в осуществлении нейротрофического контроля свойств мышечного волокна, так и в модуляции процессов секреции ацетилхолина из нервного окончания [34,35,36,37,38].
    Совокупность имеющихся на сегодняшний момент данных в отношении концевой пластинки млекопитающих однозначно демонстрирует наличие и функционирование постсинаптических глутаматных NMDA рецепторов. Несмотря на относительный недостаток экспериментальных данных, идентификация и установление локализации глутаматных рецепторов в концевой пластинке позвоночных в свете последних достижений нейробиологии представляет неоспоримые доказательства для роли глутамата в функционировании нервно-мышечного контакта. Так, в частности, данные о совместной локализации NMDA рецепторов и NO-синтазы позволяют предполагать, что эффекты, опосредуемые NO-синтазой примембранной области мышечного волокна могут если и не запускаться, то, по крайней мере, регулироваться глутаматом. Поскольку к настоящему моменту выявлено участие NO-опосредованной сигнализации в процессах метаболизма и сокращения мышечного волокна, а также в регуляции секреции ацетилхолина из двигательного нервного окончания [39,40], то можно думать, что глутамат и NMDA рецепторы способны принимать участие также в широком спектре физиологических функций системы «нерв-мышца» у позвоночных.
Заключение
Глутамат, являясь самым распространенным медиатором в ЦНС и одним из основных медиаторов в нервно-мышечных соединениях беспозвоночных, по-видимому, способен играть определенную роль и в периферических синапсах позвоночных. Глутамат, судя по всему, выделяется наряду с ацетилхолином из двигательных нервных окончаний и активирует ионотропные глутаматные рецепторы, преимущественно локализованные у холоднокровных на пресинаптической мембране, а у теплокровных – на мембране мышечного волокна. При этом в нервно-мышечном синапсе земноводных обнаружен весь спектр ионотропных глутаматных рецепторов, тогда как в концевой пластинке млекопитающих идентифицированы только NMDA рецепторы. Наиболее изученная функция глутаматных рецепторов в концевой пластинке позвоночных – модуляция процессов холинэргической медиации. Накапливаются данные и о нейротрофической роли глутамата.
Работа поддержана грантом РФФИ (№ 02-04-48903), грантом Фонда НИОКР РТ (№ 03-3.8-173) и  грантом Президента РФ «Ведущая научная школа» (НШ-1063.2003.4)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.    Fonnum F. (1984) Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain. J. Neurochem. 42, 1-11.
2.    McDonald J.W., Johnston M.V. (1990) Physiological and pathophysiological roles of excitatory amino acids during central nervous system development Brain Res. Rev. 15, 41-70.
3.    Rabacchi S., Bailly Y., Delhaye-Bouchaud N., Mariani J. (1992) Involvement of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor in synapse elimination during cerebellar development. Science 256, 1823-1825.
4.    Ozawa S., Kamiya H., Tsuzuki K. (1998) Glutamate receptors in the mammalian central nervous system.  Prog. Neurobiol. 54, 581-618.
5.    Lunt G., Olsen R. (1988) Comparative invertebrate neurochemistry. Cornell University Press, Ithaca, New York, 42-89.
6.    Salpeter M.M. (1987) The vertebrate neuromuscular junction. Alan R. Liss, New York.
7.    Nakanishi S. (1992) Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function. Science 258, 597-603.
8.    Seeburg P.H. (1993) The molecular biology of mammalian glutamate receptor channels. Trends Neurosci. 16, 359-365.
9.    Hollmann M., Heinemann S. (1994) Cloned glutamate receptors. Ann. Rev. Neurosci. 17, 31-108.
10.    Kerkut G.A., Shapiro A., Walker R.J. (1967) The transport of 14C-labeled material from CNS – muscle along a nerve trunk. Comp. Biochem. Physiol. 23, 729-748.
11.    Fu W.M., Liou H.C., Chen Y.H., Wang S.M. (1998) Coexistence of glutamate and acetylcholine in the developing motoneurons. Chin. J. Physiol. 41, 127-132.
12.    Meister B., Arvidsson U., Zhang X., Jacobsson G., Villar M.J., Hokfelt T. (1993) Glutamate transporter mRNA and glutamate-like immunoreactivity in spinal motoneurones. NeuroReport 5, 337-340.
13.    Waerhaug O., Ottersen O.P. (1993) Demonstration of glutamate-like immunoreactivity at rat neuromuscular junctions by quantitative electron microscopic immunocytochemistry. Anat. Embryol. (Berlin) 188, 501-513.
14.    Vyas S., Bradford H.F. (1987) Co-release of acetylcholine, glutamate and taurine from synaptosomes of  Torpedo electric organ. Neurosci. Lett. 82, 58-64.
15.    Israel M., Lesbats B., Bruner J. (1993) Glutamate and acetylcholine release from cholinergic nerve terminals, a calcium control of the specificity of the release mechanism. Neurochem. Int. 22, 53-58.
16.    Браун А.Д., Немчинская В.Л. (1960) Сб. «Вопросы цитологии и общей физиологии», АН СССР, М-Л., 32-42.
17.    Ашмарин И.П., Стукалов П.В. (1996) Нейрохимия. М., Изд-во ИБХ РАМН.
18.    Danbolt N.C. (2001) Glutamate uptake. Progress in Neurobiology 65, 1-105.
19.    Fu W.M., Liou J.C., Lee Y.H., Liou H.C. (1995) Potentiation of neurotransmitter release by activation of presynaptic glutamate receptors at developing neuromuscular synapses of Xenopus. J. Physiol. (Lond.) 489, 813-823.
20.    Chen YH, Wu ML, Fu WM. (1998) Regulation of presynaptic NMDA responses by external and intracellular pH changes at developing neuromuscular synapses. J. Neurosci.  18, 2982-2990.
21.    Fu W.M., Liu J.J. (1997) Regulation of acetylcholine release by presynaptic nicotinic receptors at developing neuromuscular synapses. Mol. Pharmacol. 51, 390-398.
22.    Dale N., Roberts A. (1985) Dual-component amino-acid-mediated synaptic potentials: excitatory drive for swimming in Xenopus embryos. J. Physiology 363, 35-59.
23.    Skatchkov S., Brosamle C., Vyklicky L., Kuffler D.P., Orkand R.K. (1994) NMDA receptors on adult frog spinal motoneurons in culture. Neurosci. Lett. 176, 251-254.
24.    Liou H.C., Yang R.S., Fu W.M. (1996) Potentiation of spontaneous acetylcholine release from motor nerve terminals by glutamate in Xenopus tadpoles. Neuroscience 75, 325-331.
25.    Berger U.V., Carter R.E., Coyle J.T. (1995) The immunocytochemical localization of N-acetylaspartyl glutamate, its hydrolysing enzyme NAALADase, and the NMDAR-1 receptor at a vertebrate neuromuscular junction. Neuroscience 64, 847-850.
26.    Lin Y.J., Bovetto S., Carver J.M., Giordano T. (1996) Cloning of the cDNA for the human NMDA receptor NR2C subunit and its expression in the central nervous system and periphery. Mol. Brain Res. 43, 57-64.
27.    Grozdanovic Z., Gossrau R. (1998) Co-localization of nitric oxide synthase I (NOS I) and NMDA receptor subunit 1 (NMDAR-1) at the neuromuscular junction in rat and mouse skeletal muscle. Cell Tissue Res. 291, 57-63.
28.    Kornau H.C., Seeburg P.H., Kennedy M.B. (1997) Interaction of ion channels and receptors with PDZ domain proteins. Curr. Opinion. Neurobiol. 7, 368-373.
29.    Christopherson K.S., Hillier B.J., Lim W.A., Bredt D.S. (1999) PSD-95 assembles a ternary complex with the N-methyl-D-aspartic acid receptor and a bivalent neuronal NO synthase PDZ domain. J. Biol. Chem. 274, 27467-27473.
30.    Craven S.E., Bredt D.S. (1998) PDZ proteins organize synaptic signalling pathways. Cell 93, 495-498.
31.    Lück G., Hoch W., Hopf C., Blottner W. (2000) Nitric oxide synthase (NOS-1) coclustered with agrin-induced AchR-specializations on cultured skeletal myotubes. Mol. Cell. Neurosci. 16, 269-281.
32.    Lin J.W., Wyszynski M., Madhavan R., Sealock R., Kim J.U., Sheng M. (1998) Yotiao, a novel protein of neuromuscular junction and brain that interacts with specific splice variants of NMDA receptor subunit NR1. J. Neurosci. 18, 2017-2027.
33.    Koyuncuoğlu H., Kara I., Günel M.A., Nurten A., Yamantürk P. (1998) N-methyl-D-aspartate antagonists, glutamate release inhibitors, 4-aminopyridine at neuromuscular transmission. Pharmacol. Res. 37, 485-491.
34.    Urazaev A.Kh., Magsumov S.T., Poletayev G.I., Nikolsky E.E., Vyskočil F. (1995) Muscle NMDA receptors regulate the resting membrane potential through NO-synthase. Physiol. Res. 44, 205-208.
35.    Urazaev A.K., Naumenko N.V., Poletayev G.I., Nikolsky E.E., Vyskočil F. (1998) The effect of glutamate and inhibitors of NMDA receptors on postdenervation decrease of membrane potential in rat diaphragm. Mol. Chem. Neuropathol. 33, 163-174.
36.    Urazaev A.K., Naumenko N.V., Nikolsky E.E., Vyskočil F. (1999) The glutamate and carbachol effects on the early post-denervation depolarization in rat diaphragm are directed towards furosemide-sensitive chloride transport. Neurosci. Res. 33, 81-86.
37.    Хаирова Р.А., Маломуж А.И., Науменко Н.В., Уразаев А.Х. (2002) Влияние глутамата на мембранный потенциал и объем скелетных мышечных волокон крысы после блокады NO-синтазы in vivo. Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова, 88, 1458-1466.
38.    Malomouzh AI, Mukhtarov MR, Nikolsky EE, Vyskocil F, Lieberman EM, Urazaev AK. (2003) Glutamate regulation of non-quantal release of acetylcholine in the rat neuromuscular junction. J. Neurochem. 85, 206-213.
39.    Kaminski H.J., Andrade F.H. (2001) Nitric oxide: biologic effects on muscle and role in muscle diseases. Neuromuscular Disorders 11, 517-524.
40.    Stamler J.S., Meissner G. (2001) Physiology of nitric oxide in skeletal muscle. Physiol. Rev. 81, 209-237.