Учреждение Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им.Б.П. Константинова РАН (г. Гатчина)

Наиболее часто применяемым методом клонирования плазмид является амплификация  последовательностей ДНК с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов, содержащих уникальные сайты рестрикции, и последующее встраивание этих фрагментов в плазмидный вектор. Наряду с достоинствами у этой и других методик, описанных в литературе, есть недостатки. Методика же лигазно-независимого клонирования (ЛНК) позволяет направленно и эффективно клонировать продукты ПЦР без проведения лигазной реакции in vitro. Была использована 3'→5' экзонуклеазная активность полимеразы Т4 in vitro [1]. Модифицированные плазмиды pET21d (Novagen) и pASK-IBA2 (IBA) обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BseRI и затем полимеразой Т4 в присутствии dCTP. Гены RAD51C и RAD51B H. sapiens амплифицировали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов: 5'-agattggtggcX-3' и 5'-gaggagagtttagacY-3', где X и Y – это нуклеотидные последовательности, комплементарные клонируемым генам, и обрабатывали полимеразой Т4 в присутствии dGTP. Векторы и продукты ПЦР  одновременно трансформировали в клетки E.coli DH5α, где внутриклеточные ферменты завершали процесс лигирования. Секвенирование полученных рекомбинантных векторов подтвердило соответствие последовательностей встроенных фрагментов ожидаемой последовательности ДНК.

Список литературы:

1. Stephen D. Weeks, Mark Drinker, and Patrick J. Loll Ligation Independent Cloning Vectors for Expression of SUMO Fusions // Protein Expr Purif. 2007 May;53(1):40-50.