Инфекционный мононуклеоз (ИМ) – острое, доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, ча-ще всего встречающееся в детском или юношеском возрасте. Основным, но не единственным, этиологическим фактором инфекционного мононуклеоза является вирус герпеса 4-го типа – вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) [3]. ВЭБ обладает тропностью к эпителиальным клеткам носоглотки и В-лимфоцитам. После внедрения вируса В-клетки трансформируются в ВЭБ-презентирующие клетки и приобретают способность к неограниченной про-лиферации [8].  При этом центральная роль в элиминации вируса и инфицированных клеток отводится Т-клеточному ответу, в том числе цитотоксическим и естественным клеткам-киллерам, основными формами цитотоксичности которых являются секреция цитокинов, индукция апоптоза инфицированных клеток и опо-средованный антителами киллинг [5].

Апоптоз представляет особый интерес. Он опосредует патогенез многих инфекционных заболеваний, так как их возбудители оказывают разнообразное влияние на программированную гибель клеток – стимулирую-щее или подавляющее. Попадая в организм, ВЭБ ингибирует программу апоптоза поражаемых им клеток, что опосредует его длительную (нередко пожизненную) внутриклеточную персистенцию. Наряду с этим, апопто-тическая гибель клетки-мишени, презентирующей на своей поверхности вирусные антигены, индуцируется клетками иммунной системы. Известно, что цитотоксические CD8⁺ Т-лимфоциты (ЦТЛ) и естественные киллеры способны распознавать и направленно уничтожать клетки, зараженные вирусом, не провоцируя значи-тельного воспаления. Реализация цитотоксической (апоптогенной) активности ЦТЛ и NK-клеток осуществля-ется путем экзоцитоза цитолитических факторов – перфорина и гранзимов [2]. Посредством перфорина в мем-бране клетки-мишени образуются поры, через которые поступают гранзимы (сериновые протеазы и TNFβ), напрямую активирующие каспазы-8, -3 и запускающие таким образом каскад внутриклеточных разрушений. В то же время появляются данные, что, к примеру, сами ЦТЛ являются нечувствительными к воздействию гранзимов, синтезируя специфические эндогенные ингибиторы сериновых протеаз [4]. Кроме того, реализация цитотоксичности Т-лимфоцитов (но не NK-клеток) может быть связана с индукцией рецепторзависимого апоптоза, механизмы развития которого обусловлены лиганд-рецепторными взаимодействиями между Fas-рецептором, экспрессируемым клеткой-мишенью, и Fas-лигандом Т-киллера [1]. Рецепторопосредованный и перфорин-гранзимовый механизмы могут вызывать апоптоз клеток-мишеней совместно или независимо друг от друга. Предполагается, что это главный способ Т-киллинга при вирусной инфекции [9]. В связи с этим, целью настоящего исследования явилась оценка цитотоксической (апоптогенной) активности лимфоцитов крови у детей с ИМ в период клинико-гематологической манифестации болезни и в фазу ранней реконвалесценции.

Материалы и методы. Обследовано 20 детей (12 мальчиков и 8 девочек) в возрасте от 3 до 6 лет, больных ИМ, вызванным ВЭБ, средней степени тяжести. Больные были обследованы в фазу разгара заболевания (4-15-й день болезни) и в фазу ранней реконвалесценции (спустя 26-30 дней от начала заболевания). Диагноз ИМ устанавливался по наличию типичных клинических симптомов, изменений в общем анализе крови (повыше-ние количества мононуклеарных лейкоцитов крови, появление атипичных мононуклеаров (АМ)) и положи-тельных результатов иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки крови (определяли IgМ к капсидному антигену (VCA-IgM), IgG к раннему антигену (EA IgG) и IgG к ядерному антигену (NA-IgG) ВЭБ с использованием стандартных тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Группу сравнения составили 10 здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту. Исследования проводились в соответствии с этическими нормами. Материалом исследования являлась пери-ферическая кровь. Выделение лимфоцитов из цельной крови производили на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3). Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови на клетках определяли поверхностные CD-рецепторы (CD8, CD16); для оценки апоптоза лимфоцитов перифе-рической крови исследовали количество CD95^-, CD95L^- и annexin V-положительных клеток (иммунофлуоресцентный метод). Результаты выражали в относительных (%) и абсолютных (×109/л) значениях.

Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., США). Для проверки выборочных данных на нормальность распределения использо-вали критерий Колмогорова-Смирнова. В виду отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми и независимыми выборками применяли непараметрические критерии Вилкоксона и U Манна-Уитни соответственно. Различия считали достоверными при р-уровне < 0,05.

Результаты. При исследовании субпопуляционного состава лимфоцитов у детей, больных ИМ, отмеча-лось достоверное повышение (сравнительно с нормой) абсолютного содержания CD8⁺-, CD16⁺-клеток в крови в острый период заболевания (в 2,5 раза, р<0,01 и р<0,05 соответственно) и в период ранней реконвалесцен-ции (р<0,05). Кроме того, в острый период заболевания в периферической крови отмечалось увеличение отно-сительного содержания CD8+-, CD16⁺- лимфоцитов (в среднем в 1,5 раза, р<0,05) по сравнению с показателя-ми у здоровых детей аналогичного возраста.
Также в острый период заболевания у детей, больных ИМ, было установлено повышение относительного и абсолютного содержания CD95⁺ и CD95L-презентирующих лимфоцитов в крови (р<0,01). В период выздоровления относительное содержание предуготовленных к апоптозу (CD95⁺) лимфоцитов нормализовалось, в то время как абсолютное их количество (равно как и  относительное содержание CD95L⁺-лимфоцитов), несмотря на существенное его снижение по сравнению с предыдущим этапом исследования (р<0,05), по-прежнему пре-вышало величину аналогичного показателя в группе сравнения. При этом абсолютное количество CD95L⁺-клеток в период выздоровления не претерпевало значимых изменений по сравнению с предшествующим периодом исследования. Наряду с этим, у больных ИМ в острый период заболевания и в период ранней реконвалесценции было повышенным количество annexin V-положительных лимфоцитов по сравнению с нормой (р<0,01).

Обсуждение. Увеличение численности Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+ у детей, страдающих ИМ, служит свидетельством доброкачественного течения заболевания, поскольку CD8⁺-клетки являются специализиро-ванными «клетками-убийцами», ответственными за распознавание вирусопределяющих эпитопов на поверхности инфицированных В-лимфоцитов и апоптоз ВЭБ-трансформированных клеток.  Тем самым они препятствуют малигнизации лимфопролиферативного процесса и обеспечивают иммунобиологический надзор за постоянством  клеточного состава организма [7]. Увеличение содержания СD16⁺-лимфоцитов также связано с развитием ответной иммунной реакции организма-хозяина против ВЭБ, поскольку они способны секретировать (помимо индукции апоптоза и участия в реакциях антителозависимой цитотоксичности) интерферон γ – важный компонент противовирусной защиты. Кроме того, на основании полученных результатов мы можем заключить, что при ИМ реакция цитотоксического звена иммунитета у детей 3-6 лет является долговременной, что, вероятно, объясняется не только функциональной незрелостью их иммунной системы, но и повы-шенной чувствительностью интенсивно растущего организма к неблагоприятным воздействиям [6].

Одной из антиапоптотических стратегий вирусов, как известно, является блокирование пускового сигнала программированной клеточной гибели при взаимодействии апоптогенных рецепторов и соответствующих им лигандов. Показано также, что низкая экспрессия Fas-лиганда на поверхности мембраны определяет способность инфицированной клетки «ускользать» от киллерных воздействий со стороны активированных лимфоцитов, что, несомненно, является важным условием выживания внутриклеточных патогенов, в частности вирусов [10].

Вместе с тем, нами было отмечено повышение уровня экспрессии CD95 и CD95L на поверхности лимфо-цитов в острый период ИМ и период выздоровления по сравнению с нормой. Установлено, что CD95L, связываясь с CD95 (специализированным рецептором Fas-зависимого пути танатогенной программы), включает цепь передачи сигнала, приводящего к апоптозу клеток, в том числе трансформированных вирусом, что сле-дует рассматривать при ИМ как механизм саногенеза [9].
Уровень апоптоза в популяции лимфоцитов периферической крови в работе определяли путем установления экспрессии на наружном монослое плазматической мембраны молекул фосфатидилсерина методом флуоресцентной микроскопии с использованием FITC-меченного annexin V. Релокализация фосфатидилсерина из внутреннего монослоя на поверхность мембраны отмечается, начиная с ранней стадии апоптотической гибели вплоть до полной деградации клетки, и служит сигналом к фагоцитозу апоптотирующей клетки и ее фрагментов (апоптотических тел) соседними макрофагами. Аnnexin V, принадлежащий к семейству кальций-зависимых белков, с высокой степенью аффинности связывается с экспонированными на поверхности гибнущих клеток фосфолипидами и ингибирует их провоспалительную и прокоагулянтную активность [4].

При изучении показателей, характеризующих спонтанный уровень программированной гибели лимфоци-тов у детей, больных ИМ, было зарегистрировано обогащение фракции лимфоцитов апоптотическими клетка-ми, как в острый период заболевания, так и в фазу раннего выздоровления. Это можно рассматривать как за-щитную реакцию организма, направленную на ограничение дальнейшего распространения вируса вследствие гибели зараженных В-лимфотропным вирусом (ВЭБ) клеток. С другой стороны, чрезмерная  гибель лимфоцитов, осуществляющих реализацию противовирусного иммунитета, может обуславливать дефект Т-звена и не-адекватность иммунного ответа, что позволяет вирусу длительно сохраняться в организме с формированием хронического инфекционного процесса [8].

Выводы: