Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН  (г.Новосибирск)

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2006 год, Том 3, выпуск 1), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Известно, что стабильность культуры определяется степенью устойчивость её элементов к спонтанному апоптозу [4; 6]. Клеточная культура Нер-2 широко используется для проведения многих исследований прикладного и теоретического характера в различных областях биологии и медицины [1; 2]. Изучается роль апоптоза в регуляции иммунного ответа и в иммунопатологии в целом [4; 5]. Апоптоз иммунокомпетентных клеток имеет важное значение в регуляции течения гранулематозного процесса [7].
Значение такого рода исследований определяется поиском наиболее адекватных средств повышения активности фагоцитов при иммуннодефицитных состояниях, для более полной элиминации продуктов распада тканей и бактерий, для снижения дозы наиболее токсичных антибиотиков, и в случае развития резистентности к антибиотикотерапии при тяжелых хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях [3].
Антигены бактерий вызывают активизацию фагоцитоза у макрофагов. Фагоцитоз является важным этапом, предваряющим презентацию антигена и всю дальнейшую цепочку развития иммунного ответа. Доказано, что наличие нескольких различных антигенов вызывает значительную активацию синтеза медиаторов, которая превышает суммарную продукцию цитокинов на каждый, имеющийся антиген в отдельности [8].
Инкубация клеток культуры Нер-2 с бактериальными лизатами может являться моделью для изучения влияния этих антигенов на атипичные клетки в плане возможного изменения активности развития опухоли при гранулематозах, в том числе, для выявления побочных эффектов влияния активаторов фагоцитоза окружающих опухоль макрофагов (в гранулеме) на атипичные клетки.
Изучали изменение морфофункционального состояния макрофагов в культурах перитонеальных клеток, выделенных из брюшной полости мышей линии C57BL/6. Концентрация посадки составляла 1000 тыс. перитонеальных клеток. Клетки инкубировали в термостате при температуре 37 С в растворе Игла с гидролизатом лактальбумина, добавлением L-глутамина и сыворотки крупного рогатого скота. Исходная концентрация посадки культуры Нер-2 (неоплазменного происхождения) составляла 100 тыс. клеток на флакон.
Бактериальные лизаты вносили в культуры клеток линии Нер-2 и перитонеальных макрофагов после предварительного инкубирования клеток в течение 24 часов, из расчета 1 мл лизата (содержащий материал от 15 миллиардов микробных клеток) на флакон. В состав препарата вошли лизаты наиболее часто встречающихся возбудителей заболеваний респираторного тракта, включая: стафилококки, стрептококки, нейсерии и энтерококки.
Определяли концентрацию апоптозных телец на 100 клеток, и количество морфологически измененных клеток. Результаты оценивали на 24, 48 и 72  часов инкубации. Контролем служили культуры, инкубируемые в течение 24 часов. Все последующие изменения описаны относительно контроля.
После воздействия бактериальных лизатов на клетки культуры Нер-2, у последних наблюдали характерные морфологические изменения, которые выражались в образовании светлого ободка вокруг ядра. Количество таких клеток составляло 90%. Данное явление, возможно, является следствием смещения органелл к периферии цитоплазмы, что связано с перестройкой цитоскелета клеток при воздействии на них белковых компонентов и полипептидов. Однако на наш взгляд наиболее вероятной причиной следует считать активацию белкового синтеза у клеток Нер-2 в ответ на действие компонентов бактериальных мембран, которые обладают антигенными свойствами.
При этом уместно упомянуть, что сходные морфологические проявления выявляются у таких активно синтезирующих клеток, как плазмоциты. Однако, для соблюдения корректности, следует воздержаться от проведения прямой аналогии, исходя только из данных морфологического характера. В тоже время нельзя не отметить, что увеличение относительного объема эухроматина в ядрах клеток, позволяло говорить о повышении активности их генетического аппарата.
После инкубации макрофагов с бактериальными лизатами через сутки после внесения последних в культуру наблюдали появление клеток, имевших морфологические отличия от интактных фагоцитов. К таким отличительным морфологическим признакам относили: смещение ядра к периферической зоне цитоплазмы за счет появления крупных светлых вакуолей, размеры которых варьировали в широких пределах, а их количество составляло от 2 до 8 в одной клетке. Численность таких клеток от общего количества макрофагов составляла 27,9 %, а их содержание в контрольных культурах не превышало 15,0 %.
При воздействии бактериальных лизатов относительный показатель площади перинуклеарных областей у Нер-2 на 48 часов инкубации составлял 22,4 % от площади цитоплазмы, и был сопоставим с аналогичным параметром площади вакуолей у морфологически измененных перитонеальных макрофагов (на этот же срок экспозиции) - 26,8 % от площади цитоплазмы.
Отмечали увеличение площади ядра (по отношению к видимой площади цитоплазмы) на 48 часов экспозиции, по сравнению со сроком на 24 часа у макрофагов и у клеток культуры Нер-2. Однако достоверные отличия между показателями контрольных (интактных) культур и опытных (инкубируемых с бактериальными лизатами) отсутствовали. При этом у клеток культуры Нер-2 значения ядерно-цитоплазматического индекса превышали данный показатель у макрофагов на соответствующие сроки инкубации.
Аналогичная ситуация наблюдалась относительно площади и количества ядрышек, поскольку эти параметры не изменялись под воздействием бактериальных лизатов, но их численность у клеток культуры Нер-2 превышала таковую у макрофагов на 24 и 48 часов, соответственно в 1,2 и в 1,7 раза. Это наряду с изменениями площади ядра свидетельствовало о более выраженной синтетической функции у клеток культуры Нер-2 по сравнению с макрофагами на отмеченные сроки инкубации.
Численность апоптозных телец в интактных культурах перитонеальных макрофагов возрастала на 48 часов инкубации по сравнению с контролем (на 24 часа), а при увеличении времени экспозиции (до 72 часов) имела тенденцию к снижению. Максимальные значения показателей фагоцитарной активности в этих группах были отмечены на 48 часов от начала экспозиции. Воздействие бактериальных лизатов не вызывало достоверного изменения количества апоптозных телец в культурах перитонеальных клеток. В тоже время все показатели фагоцитарной активности у перитонеальных макрофагов резко возрастали через сутки после их инкубации с лизатами бактерий (срок аналогичный 48 часам экспозиции у интактной культуры). При увеличении времени экспозиции наблюдали снижение фагоцитарной активности макрофагов в опытных и контрольных группах. Однако показатели опытных групп по-прежнему превосходили контрольные параметры.
В контрольных культурах клеток линии Нер-2 наблюдали высокую исходную концентрацию апоптозных телец (на 24 часа), значения которой были сопоставимы с таковой на 48 часов инкубации и снижалась при увеличении времени культивирования (до 72 часов). Воздействие бактериальных лизатов, вероятно, вызывало определенную активацию процесса апоптоза у клеток культуры Нер-2, о чем свидетельствовало повышение численности апоптозных телец в 1,5 раза (по сравнению с интактной культурой) через сутки от момента внесения лизатов в культуру.
Количество апоптозных телец после воздействия бактериальных лизатов на культуры перитонеальных макрофагов было в 2,5 раза больше, чем в культурах Нер-2, но достоверно не отличалось от этого показателя в интактных культурах перитонеальных клеток. Размеры апоптозных телец достоверно не изменялись на различные сроки инкубации, а также в зависимости от воздействия бактериальных лизатов на культуры Нер-2 и перитонеальных макрофагов.
Таким образом, присутствие в культуральной среде бактериальных лизатов вызывало активацию апоптоза у клеток культуры Нер-2, и существенно не влияло на данный процесс у макрофагов. При этом у последних резко возрастали показатели фагоцитарной активности.
Феномен возрастания активности апоптоза у клеток культуры Нер-2 (происходящих от злокачественной опухоли) в присутствии комплекса бактериальных лизатов может иметь весьма важное прикладное значение в плане коррекции онкологических заболеваний и требует дальнейшего всестороннего изучения.

Список литературы:
1. Ильин Д.А., Архипов С.А., Михайлова Л.П., Игнатович Н.В., Ахроменко Е.С. Морфоцитологические аспекты взаимодействия клеток в генетически гетерогенных клеточных культурах // Компенсаторно-приспособительные процессы: Всероссийская конференция. — Новосибирск, 2004. — С. 32 – 33.
2. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях. — Новосибирск: Наука, 1981. —144 с.
3. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г., Гаращенко Т.П. Применение и механизм действия ИРС19 в группе длительно и часто болеющих детей // Иммунология. – 2000. – № 5. – С. 56 – 58.
4. Фильченков А.А., Абраменко И.В. Апоптоз в патогенезе заболеваний человека. — К.: ДИА, 2001. — 324 с.
5. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология 1996, т. 6, с. 10 – 23.
6. Brodbeck W.G., Shive M.S., Colton E., Nakayama Y., Matsuda T., Anderson J.M. Influence of biomaterial surface chemistry on the apoptosis of adherent cells. // J. Biomed Mater Res. – 2001. – V. 55. – № 4. – Р. 661 – 668.
7. Klinge U., Klosterhalfen B., Birkenhauer V., Junge K., Conze J., Schumpelick V. Impact of polymer pore size on the interface scar formation in a rat model. // J. Surg Res. – 2002. – V. 103. – № 2. – Р. 208 – 214.
8. Protvinsky R. Infektabwehr im Respirationstrakt // Hippokrates. – 1975. – Bd.46. – S.374 – 384.