Туберкулёз занимает одну из ведущих позиций среди наиболее распространенных инфекционных заболе-ваний во всём мире. К настоящему времени установлено, что манифестация туберкулёзной инфекции проис-ходит в результате  снижения эффективности иммунологической защиты макроорганизма. Вместе с тем, каче-ственные изменения в геноме M.tuberculosis (МБТ) обусловливают появление  высоковирулентных лекарст-венно-устойчивых штаммов возбудителя, инфицирование которыми приводит к остропрогрессирующим рас-пространенным деструктивным изменениям в лёгочной ткани. Такие формы туберкулеза легких (ТЛ) пред-ставляют эпидемиологическую опасность и требуют длительной химиотерапии. В связи с этим, представляет-ся важным изучение роли биологических свойств M.tuberculosis в определении характера иммунологического дисбаланса, сопровождающего туберкулёзную инфекцию, что поможет облегчить прогнозирование исходов заболевания, выявление групп риска по развитию остропрогрессирующих форм болезни, позволит проводить адекватную иммунокоррекцию.

Цель исследования. Установить роль генотипических особенностей инфицирующего штамма Mycobacte-rium tuberculosis (лекарственная чувствительность, VNTR-профиль) в модуляции иммунопатологических из-менений при туберкулёзе лёгких.

Материал и методы исследования. Были обследованы 124 пациента (89 мужчин и 35 женщин) в возрасте 18-55 лет, страдающих распространённым деструктивным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких. Диагноз устанавливали на основании данных микроскопического и бакте-риологического исследования мокроты, рентгенологического исследования лёгких. Группу сравнения соста-вили 35 здоровых доноров в возрасте от 18 до 55 лет мужского и женского пола.

Материалом для иммунологического исследования являлась периферическая кровь, стабилизированная ге-парином (25 ЕД/мл), забор которой производили утром натощак из локтевой вены. Изучение генетического полиморфизма M. tuberculosis проводили на 77 клинических изолятах, выделенных из мокроты пациентов до назначения им специфической противотуберкулезной химиотерапии.
Определение общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм в периферической крови проводили с использованием общепринятых гематологических методов. Определение дифференциро-вочных антигенов лимфоцитов (CD-маркеров) проводили лимфоцитотоксическим методом с использованием наборов моноклональных антител к маркерам: CD3+ (общий маркер Т-лимфоцитов), CD4+ (маркер Т-хелперов), CD8+ (маркер цитотоксических/супрессорных Т-лимфоцитов), CD16+ (маркер натуральных килле-ров), CD45RA+ (маркер наивных Т- и В-лимфоцитов). Пролиферативную активность лимфоцитов перифери-ческой крови оценивали МТТ-методом, основанным на изменении цвета связывающегося с клетками красите-ля 3-[4,5,-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетра-золиум бромида (МТТ, тиазолил синий) из синего в желтый. Для определения цитокинпродуцирующей способности мононуклеарные лейкоциты, предварительно выде-ленные из крови на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3), культивировали в полной пита-тельной среде. Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов в пробы вносили комплексный белко-вый и липидный антигены, выделенные из M.  tuberculosis семейства Beijing, в дозе 20 мкг/мл и 50 мкг/мл со-ответственно, рекомбинантный IL-2 в дозе 5 нг/мл и вакцинный штамм БЦЖ в дозе 50 мкг/мл. Для определе-ния уровней IL-2, IL-4, IL-12 и IFNγ в супернатантах культуральных суспензий использовали твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ELISA). Для видовой идентификации M. tuberculosis и определе-ния их чувствительности к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Типирование клинических изолятов М. tuberculosis осуществляли методом MIRU-VNTR, используя 12 пар праймеров для амплификации локусов микобактериального генома: MIRU 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40. Статисти-ческую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., США).

Результаты исследований и их обсуждение. В настоящее время ведущими факторами прогрессирования туберкулёзной инфекции принято считать постепенно нарастающий в популяции иммунодефицит, а также изменения биологических свойств возбудителя – возможность персистирования в фагоцитах (повышение выживаемости в них), появление лекарственной устойчивости.
Для оценки изменений параметров иммунного статуса при лекарственно-устойчивом ТЛ (ЛУТЛ) в зависи-мости от спектра лекарственной резистентности инфицирующего штамма M. tuberculosis было проведено сравнение показателей у больных, выделяющих МБТ с  моно-, поли- и множественной лекарственной устой-чивостью (МЛУ). Анализ параметров количественного состава белой крови не выявил статистически значи-мых различий общего количества лейкоцитов и субпопуляционного состава лимфоцитов у больных ЛУТЛ в зависимости от  спектра лекарственной резистентности инфицирующего штамма МБТ – изменения носили однонаправленный характер.

Для оценки общей реактивности лимфоцитов мы ставили перед собой задачу охарактеризовать уровень пролиферативной активности клеток in vivo (активность спонтанной бласттрансформации), а также резерв пролиферации лимфоцитов в ответ на индукторы, в качестве которых использовали  белковый и липидный антигены M. tuberculosis Beijing-семейства, вакцинный штамм M. bovis (БЦЖ) и рекомбинантный IL-2.
Пролиферативная активность лимфоцитов крови на базальном уровне у больных ТЛ, инфицированных МЛУ-штаммами M. tuberculosis, была сниженной по отношению к норме, тогда как у пациентов, инфициро-ванных моно- и полирезистентными МБТ, данный показатель не отличался от контрольного. Уровень БЦЖ-индуцированного бластообразования лимфоцитов in vitro у данной группы пациентов, напротив, значимо пре-вышал соответствующие значения в группе контроля и у больных, выделяющих моно- и полирезистентные M. tuberculosis.

Исследованиями некоторых авторов установлено, что у больных ТЛ, инфицированных МБТ с высокой жизнеспособностью и нарастающим спектром лекарственной устойчивости, регистрируются более низкие показатели пролиферации лимфоцитов в ответ на туберкулин и фитогемагглютинин (ФГА), индуцированной ФГА продукции IL-2, относительного содержания лактоферрина и активности миелопероксидазы в сыворотке крови по сравнению с соответствующими параметрами у больных, выделяющих M. tuberculosis с низкой жиз-неспособностью. По всей видимости, это свидетельствует о более выраженном токсическом действии МБТ с МЛУ на клетки организма, в том числе и иммуноциты, в отличие от возбудителя с широким спектром лекар-ственной чувствительности. В данном случае можно судить об анергии Т-клеток in vivo, индуцированной воз-будителем с определенными биологическими свойствами.

Анализ цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров периферической крови при ТЛ с разным спек-тром лекарственной устойчивости выявил снижение спонтанной секреции IL-2, IL-4, и, напротив, увеличение (более значимое при полирезистентном варианте ТЛ) продукции IFNγ относительно контроля. Обращал на себя внимание высокий уровень продукции IL-12 (базальный и БЦЖ-индуцированный) в культуре мононук-леаров крови больных с монорезистентным ТЛ, который значимо превышал аналогичные значения в группе контроля и у больных с поли- и МЛУ ТЛ. Помимо этого обнаруживался резко пониженный резерв IL-2-продуцирующей способности мононуклеаров крови у больных с МЛУ ТЛ (при стимуляции клеток белковым и липидным антигенами, выделенными из МБТ семейства Beijing), что на фоне низкой базальной продукции цитокина может свидетельствовать об истощении функциональной активности Th1-лимфоцитов, возможно вследствие длительного их контакта с аналогичным антигеном в организме больного. Вместе с тем, индекс стимуляции продукции IL-4 in vitro для всех используемых индукторов был повышенным, что на фоне низкой базальной секреции цитокина подтверждает ранее сформулированное предположение о супрессии Th2-лимфоцитов in vivo  в условиях гиперсекреции IFNγ.

Неуклонный рост показателей впервые выявленного ЛУТЛ сочетается с учащением случаев инфицированности штаммами, относящимися к семейству Beijing, и приобретения вторичной антибиотикорезистентности, связанной с генетическими свойствами инфектогена, позволяющими ему быстро адаптироваться к среде макроорганизма и неблагоприятным воздействиям.

Анализ генетического полиморфизма  M. tuberculosis по MIRU-VNTR-локусам позволил заключить, что на территории г. Томска и Томской области циркулирует популяция генетически неоднородных штаммов возбу-дителя, среди которых 19% проявляют множественную лекарственную устойчивость. Приблизительно 1/3 от всей популяции составляют штаммы семейства Beijing, которые в большинстве случаев вызывают инфильтра-тивный, нежели диссеминированный ТЛ. Проведённое нами сопоставление данных определения спектра ле-карственной устойчивости и генотипического профиля выявило, что из 21 клинического изолята МБТ с VNTR-профилем, характерным для Beijing-семейства, только 12 оказались лекарственно-резистентными, а остальные 9 изолятов оказались чувствительными к противотуберкулезным препаратам основного ряда. Было установлено, что лекарственно-резистентные штаммы МБТ чаще встречаются среди клинических изолятов, принадлежащих к семейству Beijing. Так, в клинических образцах среди 77 изолятов (вся выборка) изоляты с МЛУ достоверно чаще встречались среди МБТ семейства Beijing, чем в среднем по выборке. Для анализа за-висимости изменений иммунного статуса у больных ТЛ от варианта генотипа инфицирующего штамма M. tuberculosis по результатам генотипирования возбудителя были сформированы группы обследованных лиц: в первую вошли больные, выделяющие МБТ, по генотипическим свойствам относящиеся к пекинскому семей-ству, вторую составили пациенты, инфицированные M. tuberculosis «не-Beijing»-семейства. У больных, инфи-цированных МБТ, относящимися к семейству Beijing, был выявлен лейкоцитоз, который характеризовался более высокими цифрами, чем у пациентов, выделяющих «неBeijing»-штаммы МБТ. Спонтанная пролифера-тивная активность лимфоцитов крови у данной группы больных была более высокой, на наш взгляд обеспечи-валась так называемым “заместителем IL-2” – IL-12, базальная продукция которого оказалась на высоком уровне, в отличие от параметров, определяемых у больных «неBeijing-туберкулёзом». Однако добавление в культуральные суспензии микобактериальных антигенов приводило к угнетению (относительно спонтанного) уровня лимфопролиферации у больных, выделяющих МБТ пекинского семейства; индексы стимуляции лим-фопролиферации для белкового и липидного индукторов соответственно были ниже, чем в группах сравнения. Таким образом, можно заключить, что при «Beijing»-туберкулёзе в основе угнетения функциональной актив-ности Th1-лимфоцитов лежит антиген-индуцированная анергия иммунокомпетентных клеток, т.к. нами было зарегистрировано угнетение реакции бласттрансформации лимфоцитов в ответ на экзогенное добавление бел-кового и липидного микобактериальных антигенов и рекомбинантного IL-2. В свою очередь при «неBeijing»-туберкулёзе определяющим фактором несостоятельности T-хелперных лимфоцитов I типа явился дефицит Т-активирующих цитокинов, о чем свидетельствовало увеличение лимфопролиферативной активности в ответ на добавление рекомбинантного IL-2.

1. Среди генетически неоднородных штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих на территории г. Томска и Томской области, 19% проявляют МЛУ. Штаммы семейства Beijing составляют 27% от общей по-пуляции возбудителя, имеют высокий показатель кластеризации (74%), уровень их множественной лекарст-венной устойчивости в 3 раза превышает  таковой  у «непекинских» штаммов, для которых доля кластери-зующихся штаммов составляет 11%.
2. При лекарственно-резистентном туберкулёзе лёгких выраженность нарушений функциональной активности лимфоцитов крови зависит от спектра лекарственной устойчивости инфицирующего штамма Mycobacterium  tuberculosis. При туберкулёзе лёгких с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя степень угнетения пролиферативной активности лимфоцитов и снижения резерва продукции IL-2 выше, чем у боль-ных с лекарственной полирезистентностью и монорезистентным туберкулёзом лёгких, характеризующимся высоким уровнем базальной и БЦЖ-индуцированной секреции IL-12.
3. Mycobacterium tuberculosis пекинского семейства в 10% случаев вызывают диссеминированный туберкулёз лёгких и в 90% случаев – инфильтративный туберкулёз лёгких. При этом при «Beijing-туберкулёзе» лейко-цитоз, угнетение лимфопролиферации на фоне гипопродукции IL-2 и гиперпродукции IL-12 носят более выраженный характер, чем при «неBeijing»-инфекции.