¹Научно-исследовательский институт общей патологиии патофизиологии Российской академии медицинских наук;

²Инновационный центр Сколково, Научно-исследовательский институт атеросклероза (г.Москва);

³ ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России, г. Москва.

Эта статья была опубликована в  сборнике научных трудов "Естествознание и гуманизм" с материалами Шестой Международной Телеконференции (24-29 октября 2011 года). Информационная страница сборника. 

Резюме

Проведена детекция митохондриальной замены G на A в позиции 13513 при атеросклеротических поражениях интимы аорты человека. Полученные данные демонстрируют значительные  различия между уровнем гетероплазмии мутации митохондриального генома G13513A  в участках здоровой и пораженной атеросклерозом интимы аорты человека.

Введение 

В настоящее время атеросклероз является грозным  заболеванием 21 столетия, опасность которого явно недооценена. Между тем смертность от атеросклероза является одной из самых высоких в мире. В большинстве случаев причиной развития сердечно-сосудистых заболеваний является наличие атеросклеротических поражений интимы артерий.

Исследования генома человека делают возможным раннюю, досимптоматическую диагностику атеросклероза, в частности, при помощи молекулярного тестирования генов, ассоциированных с развитием данной патологии [1-18].

В геноме человека имеются высокомутабельные области, в которых одни аллельные варианты генов могут заменяться другими в течение жизни индивида. Наиболее часто соматические мутации возникают в митохондриальном геноме. Пенетрантность данных мутаций варьирует в широких пределах и зависит от уровня гетероплазмии (смеси мутантных и нормальных молекул митохондриального генома). Поэтому при изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями человека необходима количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (уровня гетероплазмии) [4-18]  .

В настоящей работе проведен пилотный анализ мутации G13513A  митохондриального генома человека в образцах ДНК, выделенных из нормальной и пораженной атеросклерозом интимы аорты  индивидов. Мутация локализована в кодирующей области митохондриального генома, в частности, в гене субъединицы 5 NADH дегидрогеназы. Она вызывает дефект пятой белковой субъединицы данного фермента дыхательной цепи митохондрий [1,4].

Материалы и методы 

            Материалом исследования служили образцы ткани из интимы аорты, печени и мышцы 7 лиц, погибших в результате несчастного случая или внезапной смерти. 

Выделение ДНК     

Митохондриальную ДНК выделяли из образцов с помощью набора AQUAPURE GENOMIC TISSUE KIT фирмы BioRad, следуя соответствующим протоколам.  

ПЦР

Амплификацию фрагмента размером 335 п.н., содержащего область мутации G13513A, осуществляли со следующими праймерами:

1.Прямой праймер CCTCACAGGTTTCTACTCCAAA (13491 – 13512);

2.Обратный праймер bio-AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGAGG (13825-13806).

Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 0,4 - 0,6 мкг митохондриальной ДНК; 16,6 мкМ (NH₄)₂SO₄; 0,3 пикомоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 67 мМ трис/HCl ( pH 8,8 ), 1,5 mM MgCl₂  и 3 ед. Taq-полимеразы.

Режим ПЦР: денатурация ДНК при 94⁰ C в течение 3–х минут, затем:

94⁰ C – 30 сек., 55⁰ C – 30 сек., 72⁰ C –1 мин., всего – 35 циклов, с заключительным синтезом при 72⁰ C  в течение 7 мин.

Пиросеквенирование

Пиросеквенирование амплификатов для выявления точечной однонуклеотидной замены G на A в гене субъединицы 5 NADH дегидрогеназы 

в позиции 13513 митохондриального генома человека  проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQ^TMHS96MA [19-24].

Последовательность праймера для пиросеквенирования была такой:

AGGTTTCTACTCCAA ( 13497 - 13511 ).

Визуализация результатов осуществлялась на основе программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора, с помощью нового оригинального метода, разработанного авторами.  

Результаты и обсуждение

Для подсчета процента гетероплазмии мутаций по данным пирограммы используется ранее  разработанная авторами формула №1:

где P – процент гетероплазмии;

h –высота пика исследуемого нуклеотида;

N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей;

M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.

Разработана и частная формула №2 для данной мутации. Исходя из гистограммы, полученной для G3513A , при 100% нормальных аллелей 13513G размер пиков составляет - 1 ед. A ( пик №2), 1 ед. G (пик №3 ), 1 ед. A ( пик №4 ) (рис.1а ) ; при 100% мутантных аллелей 13513A - 3 ед. A, 0 ед. G,  0 ед. A  ( рис.1б ). Как видно из гистограммы, процент гетероплазмии необходимо анализировать по пику A (№2), т.к. именно в этой позиции происходит замена G на A . Cуммируем данные по трем пикам, принимаем сумму за 3 единицы, после чего рассчитываем, сколько единиц  составляет мутантный пик A ( №2 ).  Таким образом,  формула №2 для расчета процента гетероплазмии для G3513A выглядит так:

Например, при исследовании образца ДНК из липофиброзной бляшки 43-летнего мужчины, на пирограмме можно видеть, что пик A ( пик №2) составляет 10,76; пик G ( пик №3) – 4,64; пик A (пик №4) – 5,18 ( рис.1в). Сумма пиков – 20,58. Принимая во внимание, что  сумма равна 3 ед., размер мутантного пика A составляет 1,6 ед. Исходя из формулы №2, процент гетероплазмии по мутации G13513A составляет 30%.

Для 6 из 7 (86%) исследованных аорт были обнаружено, что процент гетероплазмии по мутации G13513A в липофиброзных бляшках значительно выше по сравнению с нормальной сосудистой тканью. В контрольных образцах из печени и мышцы процент гетероплазмии по данной мутации оказался существенно ниже, чем в пораженных атеросклерозом участках интимы (рис.1, д-е).

Заключение.

Исследование однонуклеотидной замены G на A митохондриального генома человека в позиции  13513 показало весьма значительные отличия между процентом гетероплазмии в  липофиброзных бляшках и нормальной  интиме аорты, а также между различными органами и тканями. Данная информация может быть полезна для выявления причин возникновения и развития атеросклеротических поражений человека и  проведения ранней своевременной диагностики.

Рисунок 1.

а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по нормальному  аллелю 13513G в 100% митохондриальных хромосом;

б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по мутантному аллелю 13513A в 100% митохондриальных хромосом;

в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК  из участка сосудистой стенки №1 (гетероплазмия по мутации G13513A, 30% мутантных хромосом );

г) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК  из участка сосудистой стенки №2 (гетероплазмия по мутации G13513A, 20% мутантных хромосом );

д) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК  из участка мышечной ткани ( гетероплазмия по мутации G13513A, 15 % мутантных хромосом );

е) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК  из участка ткани печени  ( гетероплазмия по мутации G13513A, 8% мутантных хромосом ).

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации.

Список литературы

1. Иванова ММ, Сазонова МА, Желанкин АВ, Митрофанов КЮ, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Мясоедова ВА, Постнов АЮ, Орехов АН. Мутации митохондриального генома в патологии человека. Фундаментальные науки и практика 2010,1(4)164-167.

2. Желанкин АВ, Сазонова МА. Роль мутаций митохондриального генома человека в развитии сахарного диабета 2 типа, артериальной гипертонии и различных видов кардиомиопатии. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)85-87

3. Митрофанов КЮ, Сазонова МА. Связь мутаций митохондриального генома человека с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)92-96

4. Sazonova M, Budnikov E, Khasanova Z, Sobenin I, Postnov A, Orekhov A. Studies of the human aortic intima by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome. Atherosclerosis. 2009, 204(1):184-190. (Epub 2009 Sep 4).

5. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин А.В., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Прямая количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома.// Фундаментальные науки и практика, Материалы трудов второй международной телеконференции, 2010 г.,  т.1, №2, стр.19-21.

6. Sazonova MA, Budnikov YY, Khazanova ZB, Postnov AY, Sobenin IA, Orekhov AN. Direct quantitative assessment of mutant allele in mitochondrial genome in atherosclerotic lesion of human aorta. 76th Congress of the European Atherosclerosis Society, Helsinki, Finland, June 10-13, 2007. Atherosclerosis Suppl. 2007 8(1):45-46.

7. Postnov AY, Sazonova MA, Budnikov YY, Khazanova ZB, Sobenin IA, Orekhov AN. Association of somatic mitochondrial mutations with atherosclerosis. 76th Congress of the European Atherosclerosis Society, Helsinki, Finland, June 10-13, 2007. Atherosclerosis Suppl. 2007 8(1):46.

8. Sazonova M, Andrianova I, Khasanova Z, Sobenin I, Postnov A. Quantitative mitochondrial genome mutation investigation and possible role of the somatic mutations in development of atherosclerotic lesion of human aorta. 77th Congress of European Atherosclerosis Society, Istanbul, Turkey, April 26-29, 2008. Atherosclerosis Suppl. 2008, 9(1):113.

9. Sazonova MA, Budnikov YeYe, Khazanova ZB, Postnov AYu, Sobenin IA, Orekhov AN. Possible role of somatic mitochondrial mutations in the development of atherosclerotic lesion of human aorta. ACC 57th Annual Scientific Session, Chicago, USA, March 29 – April 1, 2008. J Am Coll Cardiol 2008, 51(10) Suppl.A:A285.

10. Сазонова МА, Андрианова ИВ, Будников ЕЮ, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Постнов АЮ, Орехов АН. Прямая количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома. XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 14-18 апреля 2008. Тезисы докладов, стр. 414.

11. Собенин ИА, Мясоедова ВА, Сазонова МА, Кириченко ТВ, Чупракова ОВ, Кожевникова ЮА, Орехова ВА, Рудимов ЕГ, Орехова ЕА, Савинкова ИГ, Неробов ПЛ, Орехов АН. Разработка метода комплексной оценки риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений на основе анализа генотипа и фенотипа. Сборник тезисов. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления <Живые системы> ФЦП <Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы>. Москва, 25-27 ноября 2009 г., 134-135

12. Сазонова МА, Иванова ММ, Желанкин АВ, Митрофанов КЮ, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Мясоедова ВА, Постнов АЮ, Орехов АН. Ассоциация мутации митохондриального генома 652INSG с атеросклеротическими поражениями человека. Фундаментальные науки и практика 2010,1(4)168-171

13. Сазонова МА, Иванова ММ, Желанкин АВ, Митрофанов КЮ, Коробов ГА, Мясоедова ВА, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Постнов АЮ, Орехов АН. Детекция митохондриальной делеции гуанина в позиции 652 при атеросклеротических поражениях человека. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)105-107

14. Собенин ИА, Сазонова МА, Мясоедова ВА, Кириченко ТВ, Иванова ММ, Постнов АЮ, Орехов АН. Полиморфизм 3256С/Т митохондриальной ДНК как маркер ишемической болезни сердца и атеросклероза. Проблемы и перспективы современной науки 2011,3(1)108-110

15. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин А.В., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б.,Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Детекция мутации митохондриального генома человека 652insG при атеросклеротических поражениях сосудов человека. Молекулярная диагностика-2010. Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том V, стр. 109-112.

16. Постнов А. Ю., Сазонова М.А., Собенин И.А. Прямая количественная оценка аллеля митохондриального генома, первые результаты: ассоциация с атеросклерозом. Молекулярная диагностика-2010. Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том III , стр. 109-112.

17. Сазонова М.А., Желанкин А.В. , Иванова М.М. , Митрофанов К.Ю. , Постнов А.Ю. , Орехов А.Н. , Собенин И.А. Анализ мутации митохондриального генома A1555G при атеросклерозе интимы аорты человека. Современный мир, природа и человек, 2011, 2(1) 67-69.

18. Желанкин А.В., Сазонова М.А., Коробов Г.А., Хасанова З.Б., Постнов А.Ю., Орехов А.Н., Собенин И.А. Детекция замены тимина на цитозин в позиции 3336 митохондриального  генома при атеросклеротических поражениях человека. Современный мир, природа и человек, 2011, 2(1) 59-61.

19. Alderborn A., Kristofferson A., Hammerling U. Determination of single-nucleotide polymorphisms by real-time pyrophosphate DNA sequencing. // Genome Res., 2000,V.10, P.1249-58.

20. Agaton C., Unneberg P., Sievertzon M. et al. Gene expression analysis by signature pyrosequencing.//  Gene, 2002, May 1, V. 289 ( 1 - 2 ), P. 31 - 39.

21. Wasson J., Scolnick G., Love-Gregory L.  et al. Assesing allele frequencies of single nucleotide polymorphisms in DNA pools by pyrosequencing technology.// BioTechniques, 2002, May, V.32, P.1144 - 52.

      22. Ronaghi. M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.// Genome Reseach, 2001, V.11, P. 3 - 11.

      23. Sinclair A., Arnold C., Woodford N. Rapid detection and estimation by pyrosequencing of 23S rRNA genes with a single nucleotide polymorphism conferring linezolid resistance in Enterococci. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003,Vol.47, P.3620-22.

      24. Chen D.C., Saarela J., Nuotio I., Jokiaho A., Peltonen L., Palotie A. Comparison of GenFlex Tag array and Pyrosequencing in SNP genotyping. // J. Mol. Diagn., 2003,Vol.5, P.243-249.